金纳米电极对多巴胺和5-羟色胺的电化学富集和拉曼光谱检测

    杨丹 周晶 李语静 赵锐 冯文南 何劲 王哲 杨国程

    

    

    

    摘?要?对小分子神经递质多巴胺（Dopamine，DA）和5-羟色胺（5-Hydroxytryptamine，5-HT）的同时分析和检测是生命科学领域中的研究热点。单一的电化学检测手段难以有效地识别分析物，因此，多模量的同时分析尤为重要。本研究在碳纳米电极（Carbon-nanoelectrode nanopipette，CNE-NP）的基础上，通过电化学反应在其尖端沉积金，构建了一种具有电化学特性和拉曼活性的双功能金纳米电极（Gold-nanoelectrode nanopipette，GNE-NP） 。经过交流介电泳（Dielectrophoresis，DEP）富集后，可用于对低浓度的DA和5-HT的检测分析。研究结果表明，此电极实现了两者的电化学响应的增强和区分。此外，引入的银纳米颗粒（AgNPs）作为拉曼增强因子和捕获分析物的纳米颗粒，同样地经过DEP富集方法，使分析物的拉曼信号增强了2个数量级，且能对共混物进行特征峰的区分。将此电极应用于血浆样品分析，可得到富集增强的电化学响应，但电化学响应会受到富集次数的限制。

    关键词?基于纳米孔道的金纳米电极;多巴胺;5-羟色胺;介电泳富集;表面增强拉曼光谱

    1?引 言

    在中枢神经系统中，多巴胺（DA）和5-羟色胺 （5-HT）是两种重要的神经递质[1]。其中，DA作为重要的儿茶酚胺类神经递质分子，参与人体脑部工作和体液循环，是一种兴奋神经的神经递质[2];而5-HT多为抑制兴奋的神经递质[3]。由于DA和5-HT在生命体系统中是同时存在的，因此，二者的同时检测并区分显得尤其重要。目前，关于提高DA[4，5]和5-HT[6]检测的选择性和灵敏度的研究方法较多，其中，电化学技术由于具有简单操作、高选择性和高灵敏度等特点而得到广泛的关注。

    基于纳米孔道（Nanopipette，NP）的纳米电极在电分析检测中具有独特的优势，近年来备受关注[7～9]。NP可用于制造成内壁/外壁金属的[10，11]、内壁碳填充的[12]或者其它导电材料修饰的[13]等具有不同的功能和构造的纳米电极，还可以通过电化学、光化学或者界面反应等进一步修饰[14～16]。尽管NP在环境检测和扫描电化学显微镜等[8，17]领域的应用都取得了很大的进展，但对准确识别生物小分子，尤其是在人体样品分析方面仍面临着巨大的挑战。近年来，已有许多关于生物小分子的电化学检测的报道[18～20]，然而在体内和体外传感中对各种神经递质（如DA、5-HT、抗坏血酸、去甲肾上腺素等）的检测，多集中在提高电化学信号的灵敏度以及特异性检测的研究。这是由于神经递质的释放速度快，且在细胞外环境中的浓度低[1]，导致检测到的电化学信号弱。虽然有多种方法可以提高这些具有电化学活性的小分子神经递质在纳米电极上的电化学响应[21，22]，但在同时测定这些神经递质分子时，由于性质相近，电化学信号互相之间存在干扰[4]，通常需要对电极表面进一步修饰，才可以达到高灵敏度和特异性检测的要求。同时，考虑到仅依靠单一的电化学信号无法获取多种有用信息，而表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）作为一种精确的、无损伤的光谱技术，可以更好地辅助检测和区分，实现无损检测和分子官能团的确认。

    本研究制备了一种基于NP的金纳米电极（Gold nanoelectrode-nanopipette，GNE-NP），通过在纳米电极尖端上电化学沉积金，使得纳米电极同时具有电化学特性和拉曼活性。在本研究组之前的报道中[23，24]已经证明了基于NP的碳纳米电极可以通过交流介电泳（Dielectrophoresis，DEP）富集方法，在电极尖端附近快速富集带电荷的分子或纳米颗粒，为增强DA和5-HT分子电化学信号和拉曼信号提供了有效的检测手段。本研究结果将有助于更深入研究DA和 5-HT二者之间的电化学行为，并提供了有效增强电化学和拉曼光谱检测信号的方法。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    CHI 852D电化学工作站（上海辰华公司）;SRS DS345函数发生器（美国斯坦福公司）;P-2000 CO2激光拉制仪、QF-100-7.5石英玻璃管（美国Sutter公司）;JEOL JSM-7610F扫描电镜（日本电子公司）;LabRAM HR Evolution激光拉曼光谱仪（法国Horiba公司）;磁力加热搅拌器（上海精密科学仪器有限公司）;烧制碳电极设备（自建）;500 mL丁烷气瓶（纯度99.9%），Φ 0.25 mm Ag/AgCl丝和Φ 0.5 mm的铂丝（北京国药试剂公司）。

    四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O，上海麦克林公司）;三氯化六氨合钌（Ru（NH3）6Cl3）、盐酸多巴胺（DA）、盐酸5-羟色胺（5-HT）（Sigma Aldrich公司）;AgNO3、三水合柠檬酸三钠（北京国药试剂公司）;HCl、H2SO4（98%）、无水乙醇、H2O2（37%）、1×PBS溶液（pH=7.43）等试剂均为分析纯;实验用水均为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ·cm）。实验所用血清由当地医院提供。

    2.2?实验方法

    2.2.1?金纳米电极的制备与表征?（1）拉制纳米孔道电极?石英管（长度7.5 cm，内径0.5 mm，外径1.0 mm）分别用Piranha洗液（H2SO4-H2O2，3∶1，V/V）、水、乙醇清洗，再用氮气吹干，保持干燥。将石英管置于P2000拉制仪上拉制出两根对称的孔径约100 nm的纳米孔道电极，拉制参数如下：Heat=670;FIL=5;VEL=60;DEL=145;PUL=100。（2）烧制碳电极?参考文献[23]的方法。在纳米管内通入～30 kPa的丁烷气体，并对准尖端进行高温烧制，丁烷气体通过高温热解会在石英管孔道内壁沉积碳，从而制备得到碳纳米电极（Carbon nanoelectrode-nanopipette，CNE-NP）。最后，在碳纳米电极的尖端利用电化学沉积金。Ag/AgCl丝为参比电极，铂丝为对电极，镀金溶液为1 mmol/L HAuCl4的PBS溶液，电沉积电位为70 mV，并控制沉积电流达到40 nA时停止电沉积。制备好的GNE-NP用水冲洗干净，氮气吹干。NP、CNE-NP及GNE-NP分别采用扫描电镜进行形貌表征。（3）电化学检测?采用循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）对GNE-NP电极镀金前后的电化学性能进行对比。Ag/AgCl为参比电极，铂丝电极为对电极，1 mmol/L Ru（NH3）6Cl3作为电化学探针。循环伏安和差分脉冲伏安（Differential pulse voltammetry，DPV）檢测均在CHI 852D电化学工作站上进行，电流精度0.01 pA。