化学衍生-液相色谱-串联质谱法测定加热卷烟烟气中的醛酮类香味成分

    罗彦波 陈小静 李翔宇 张洪非 朱风鹏 姜兴益 庞永强

    

    

    

    摘 要 建立了化学衍生结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测加热卷烟烟气中9种醛酮类香味成分的分析方法。样品和标准溶液中的目标分析物分别用1-（2-肼基-2-氧代乙基）吡啶-1-溴化物（吉拉德P试剂，GP）和d5-GP衍生，以标准溶液的衍生化产物作为稳定同位素内标，采用多反应监测模式检测。在最优的衍生化反应条件下，9种醛酮类香味成分在各自浓度范围内线性关系良好，标准曲线相关系数（R2）≥0.9937，检出限为0.07～12.66 ng/mL，相对标准偏差为0.2%～11.6%。9种醛酮类香味成分在3个加标水平下的回收率为82.5%～118.0%。本方法可用于加热卷烟烟气中醛酮类香味成分的检测。

    关键词 化学衍生;液相色谱-串联质谱;加热卷烟;醛酮类香味成分

    1 引 言

    烟草及烟气品质的控制和评价是烟草行业关注的重要问题[1]，其中，非烟气的化学组成与烟气品质密切相关，烟气的化学组成影响烟气的香味和吃味，因此，烟气香味成分的研究一直备受重视。醛酮类香味成分是烟草中数量最多的一类香味成分[2]，目前，烟气中已鉴定出的醛酮类香味成分超过500种。许多重要香味成分属于醛酮类[3]，如3-甲基-2-环戊烯-1-酮在烟气中能产生甜的、焦糖-枫槭的气息;4-庚酮则能产生甜的、水果的气息;一些高沸点的酮（如紫罗兰酮）也有明显的致香作用，不少已用于烟草制品的加香中[2]。有研究表明，醛酮类香味成分的组成和相对含量综合影响烟气的品质香味情况[4]。因此，有必要对烟气中醛酮类香味成分进行分析研究。

    目前，醛酮类化合物的检测方法主要有气相色谱-质谱联用法[5～9]、高效液相色谱-二极管阵列检测/紫外检测法[10～13]和高效液相色谱-质谱联用法[14～16]等。由于醛酮类化合物缺少发色团和易电离基团，因此，在进行紫外和质谱分析前，需要通过衍生引入发色团或易电离基团，以提高紫外检测的吸光度和质谱检测的离子化效率[17，18]。质谱检测常用的衍生化试剂有亚硫酸铵[19]、伯胺类[20，21]、肼类[22～29]和酰肼类[30～34]等。吉拉德P试剂（GP）是常用的酰肼类衍生化试剂，其结构中含有恒带正电荷的季铵盐结构，因而能够显著提高衍生化产物在质谱中的离子化效率和检测灵敏度。GP已被用于人和牛体液中类固醇激素[31，35]、血浆和干血点中性激素[36，37]等的分析。结果表明，GP可选择性地与醛酮类化合物高效反应，在分析上述复杂样品中具有优良的表现。然而，目前尚未见GP用于卷烟烟气中醛酮类香味成分检测的报道。

    烟气中的醛酮类化合物主要是碳水化合物在加热条件下产生的，当加热温度高于300℃时，醛酮类化合物是构成烟气香味的主要成分之一[38]。与传统卷烟相比，加热卷烟烟气中大多数化学成分的释放量显著降低，而以“加热而非燃烧烟丝”为特征的加热卷烟（加热温度约为350℃）在加热过程中具备醛酮类香味成分生成的物质基础和形成条件，因此，加热卷烟烟气中醛酮类香味成分的降低比例有限[39，40]。由于制造工艺和添加原料的差异，不同加热卷烟烟气中的醛酮类香味成分的种类也不同。目前，烟气中醛酮类物质的分析方法主要采用外标法或单一内标法进行定量分析，而且目标分析物多为有害的羰基化合物，个别针对香味成分的检测方法存在目标分析物的种类和结构较为单一的问题。

    因此，本研究利用GP和d5-GP分别衍生样品和标准溶液中的醛酮类香味成分，并以d5-GP的衍生化产物为目标分析物的稳定同位素內标。在目标分析物的选择方面，本研究以烟草制品许可使用的醛酮类化合物和烟草在加热过程中生成的醛酮类化合物为基础，同时考虑对卷烟品质的影响和化学结构（不同碳链长度、含有其它不同的官能团、不同羰基或醛基数目），选择了如图1所示的9种代表性目标分析物。其中，3-甲基-2-环戊烯-1-酮、庚醛和4-庚酮为烟草在加热过程中生成的目标分析物，其余6种化合物为烟草制品许可使用的醛酮类化合物添加剂。将GP应用于加热卷烟中醛酮类香味成分的检测，通过衍生化反应向目标分析物分子中引入同位素基团，并作为内标，建立了加热卷烟烟气中醛酮类香味成分的分析方法。本方法显著提高了目标分析物的灵敏度，对烟气中醛酮类香味成分的分离和分析具有参考意义。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    Agilent 1200液相色谱仪（美国Agilent公司）和AB SCIEX 4000三重四极杆质谱仪（美国AB公司），配备有G1311A输液泵、G1322A在线脱气机、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱和Analyst 1.5.2工作站。CP224S电子天平（德国Sartorius公司）;SM450型20通道吸烟机（配加热卷烟分析套件，英国Cerulean公司）; 44 mm剑桥滤片（德国Borgwaldt-KC公司）;SB25-12DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）;SHA-B恒温振荡器（常州国华电器有限公司）;TurboVap LV氮气浓缩仪（瑞典Biotage公司）;Heidolph多位涡旋仪（德国Heidolph公司）。

    GP和d5-GP（纯度≥99%，美国Avanti Polar Lipids Inc公司）;9种醛酮类化合物：3-羟基-2-丁酮（纯度≥99.4%）、3-甲基-2-环戊烯-1-酮（纯度≥99.4%）、2，3-丁二酮（纯度≥97.0%）、苯甲醛（纯度≥995%）、己醛（纯度≥95.0%）、4-庚酮（纯度≥99. 8%）、庚醛（纯度≥97.0%）、壬醛（纯度≥99.5%）和紫罗兰酮（纯度≥96.0%），均购自美国Sigma-aldrich公司;甲醇和乙腈（色谱纯，德国Merck公司）;甲酸（色谱纯，美国Aladdin公司）;冰醋酸（色谱纯，美国Fisher Scientific公司）;实验用水为Q-POD Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）制得的超纯水。

    2.2 仪器条件

    液相色谱条件：色谱柱为Shimadzu VP-ODS（150 mm × 2.0 mm，5 μm），柱温为40℃，流速为0.2 mL/min，流动相A和B分别为0.1%（V/V）甲酸和乙腈。梯度洗脱：0～5 min，5% B;5～22 min，5%～40% B;22～40 min，40%～90% B; 40～45 min，90% B; 45～48 min，90%～5% B; 48～60 min，5% B。进样体积为10 μL。

    质谱条件：离子源为电喷雾离子源;电喷雾电压为5500 V，气帘气压力为68.95 kPa，雾化气压力为75.84 kPa，碰撞气（Ar气）压力为41.37 kPa;扫描模式为多反应监测;其它质谱参数见表1。

    2.3 样品制备

    本研究的目的是建立加热卷烟中醛酮类香味成分的分析方法，因此，直接采用文献报道的方法对加热卷烟进行抽吸，并对其烟气冷凝物进行提取[41，42]。由于加热卷烟烟气冷凝物的基质比传统卷烟烟气简单，主要为水分、丙二醇和丙三醇等。因此，冷凝物提取液直接进行衍生化处理。具体步骤：采用ISO抽吸模式规定的抽吸参数对加热卷烟样品进行抽吸，再将捕集有烟气总粒相物的滤片用15 mL甲醇超声提取30 min，静置，取1.0 mL上清液进行衍生。衍生时，在上清液中依次加入125 μL冰醋酸和GP溶液（3.0 μmol/L，溶于甲醇），涡旋混合后在40℃下振荡反应2 h，氮气吹干，以1.0 mL甲醇-水（1∶1，V/V）溶液复溶。在对标准溶液进行衍生时，称取适量目标分析物标准品，用甲醇配制成不同质量浓度

    的系列混合标准工作溶液，再分别取系列混合标准工作溶液进行衍生，衍生步骤同上。用d5-GP溶液（3.0 μmol/L，溶于甲醇）代替GP溶液对混合标准溶液进行衍生，衍生步骤同上。分别取20 μL复溶后的d5-GP衍生化产物添加至GP衍生后的系列混合标准工作溶液和样品溶液，混匀，待测。

    3 结果与讨论

    3.1 GP标记的醛酮化合物的质谱特征

    GP中带孤电子对的氮原子可以进攻羰基基团上带正电荷的碳原子发生亲核加成反应，生成的羟胺类化合物经脱水后形成稳定的腙，其反应示意图如图2所示。经衍生化反应后目标分析物在结构中引入了带正电荷的季铵基团，可以提高质谱响应信号。因此，本研究首先考察了GP标记的目标分析物的二级碎裂行为，结果如图3所示。所有的目标分析物被GP标记后都能产生一个丢失79 Da的子离子和相同的碎片离子m/z 80，这是由衍生化试剂中的吡啶环引起的[30，35]，说明衍生化试剂GP能够标记本实验中的目标分析物。标记后的目标分析物具有较好的碎裂行为，丢失吡啶环后，离子[M·GP-Br-Py]的质谱响应信号相对较强，而且附近没有其它碎片离子的干扰，这有利于对标记后的目标分析物进行多反应监测模式检测。

    3.2 衍生化条件的优化

    为了得到较好的标记效率，考察了醋酸和GP的用量、反应温度和时间等影响衍生化效率的因素。

    在衍生化反应中，醋酸可以提供酸性的催化环境，在冰醋酸占整个反应体系体积的0～10%（V/V）范围内，考察了冰醋酸用量的影响。结果表明，当冰醋酸的体积为5%（V/V）时，衍生化产物与内标的峰面积比值达到最大，继续增大醋酸用量，峰面积的比值基本保持不变。

    通过改变衍生化试剂的用量，使GP与目标分析物的物质的量的比值为10～1000。结果表明，随着衍生化试剂用量的增加，衍生化产物与内标的峰面积比值逐渐增加，当物质的量的比值达到500时，峰面积的比值基本不再变化。标准工作曲线绘制以及实际样品分析时衍生反应中，为保证衍生化反应完全，选择GP与待测物的物质的量的比值远超过500。

    文献[30，35～37]报道的GP试剂标记的反应温度为室温～70℃，由于本研究的衍生化反应在甲醇（沸点为65℃）中进行，因此，选择的反应温度范围为30℃～60℃。结果表明，在30℃～60℃范围内，反应温度对衍生化产物与内标的峰面积比值影响不大，为了保证稳定的衍生化效率，选择40℃作为后续的反应温度。

    考察了反应时间对衍生化效率的影响。结果表明，在0.5～6 h范围内，当反应时间从0.5 h延长到3 h时，衍生化产物与内标的峰面积比值逐渐增加，继续延长反应时间，峰面积比值增加不明显。

    综上，选择的最优的衍生化条件为：冰醋酸体积为5%（V/V），反应温度为40℃，反应时间为3 h。

    3.3 衍生前后灵敏度比较

    由于衍生化产物中含有恒带正电荷的季铵盐基团，因此，衍生化处理可增加醛酮化合物在电喷雾离子源中的离子化效率和质谱响应，有助于解决醛酮类香味成分因缺少易电离基团而无法用质谱直接检测的难题。将9种醛酮类香味成分用质谱进行检测，目标分析物标准溶液未经衍生直接进行液相色谱-质谱分析，只检测到3-甲基-2-环戊烯-1-酮和紫罗兰酮的质谱信号;目标分析物标准溶液经过GP衍生后进行液相色谱-串联质谱分析，所有目标分析物均有质谱响应。经过衍生后，3-甲基-2-环戊烯-1-酮和紫罗兰酮的灵敏度分别提高了36和27倍，其余7种化合物（直接进行液相色谱-质谱分析没有信号）在衍生化之后的质谱信号都比3-甲基-2-环戊烯-1-酮强，可以推测其灵敏度提高的倍数更大。以上结果说明，GP衍生化处理可显著提高目标分析物的灵敏度。

    3.4 方法分析性能

    考察了GP标记后衍生化产物的稳定性。将标记后的产物在0～4℃下避光保存，分别在第0、6、12和24 h进行液相色谱-串联质谱分析。结果表明，9种衍生化產物的峰面积没有明显变化，相对标准偏差在1.0%～11.9%之间，说明此保存条件下衍生化产物在24 h内稳定，保证了方法的准确性和重复性。由于经过衍生化处理的样品可在24 h内进行液相色谱-串联质谱分析，因此，本研究未对样品进行更长时间的稳定性考察。

    在优化条件下，考察了方法的检出限、定量限和线性范围。检出限和定量限为衍生化产物信噪比为3和10时对应的浓度。以目标分析物浓度为横坐标，以目标分析物与内标峰面积之比为纵坐标，绘制工作曲线。如表2所示，9种目标物的检出限在0.07～12.66 ng/mL之间，定量限在0.22～42.19 ng/mL之间，线性相关系数R2≥0.9937。

    为了考察本方法的重现性，制备3种浓度（各目标分析物线性范围最低值的2、10和40倍）的样品，以1天内制备的5个样品和连续3天配制的样品进行分析，计算日内和日间精密度（相对标准偏差）。如表3所示，目标分析物的日内及日间精密度分别不大于10.8%和11.6%，说明本方法重现性良好。

    3.5 实际样品分析

    采用本方法对两种典型加热卷烟（iQOS和glo）进行分析。在iQOS和glo烟气中检测到3-羟基-2-丁酮，其含量均低于本方法的定量限;在glo烟气中检测到2，3-丁二酮，其含量为39.18 ng/支。

    如图4所示，目标分析物的定量分析不存在干扰。由于目前没有分析加热卷烟烟气中醛酮类香味成分的标准方法，文献[39]报道glo烟气中2，3-丁二酮的含量为33.60～43.80 ng/支。以iQOS和glo进行回收率测定，在超声提取阶段加入9种目标分析物的混合标准溶液，3种加标水平分别为各目标分析物线性范围最低值的2、10和40倍，每个浓度水平重复测定5次。如表4所示，实际样品中目标分析物在不同浓度下的回收率为82.5%～118.0%，说明本方法的准确度好，可用于分析加热卷烟烟气中的醛酮类香味成分。

    4 结 论

    采用化学衍生标记技术，建立了液相色谱-串联质谱法同时测定醛酮类香味成分含量，并用于实际加热卷烟烟气样品的分析。本方法具有靈敏度高、快速、准确的优点，可以满足加热卷烟烟气中醛酮类香味成分高灵敏度检测的需求，同时也为其它类似样品中醛酮类化合物的分析提供了参考。

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