不同磷源在红霉素工程菌发酵过程中的作用研究

    丁彦琴 伍涵宇 牛春 张萍

    

    

    

    摘要：通过向红霉素种子液和发酵培养基中添加磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，探讨2种磷源对红霉素培养发酵过程中的pH、菌体浓度及效价的影响，以及进一步优化得到最佳的培养基组分配比。结果表明，与原始工艺相比，向红霉素发酵液中增添适量的磷酸氢二钾作为无机磷源能增加红霉素的产量，使发酵摇瓶中红霉素效价提高了20%，达到7 560 U/mL;采用正交法对发酵液培养基中的淀粉、糊精、磷酸氢二钾和黄豆饼粉进行了相应的优化，效价升高至7 910 U/mL，较未优化提高4.6%，较未加入磷酸氢二钾发酵液提高了25.7%。

    关键词：红色糖多孢菌;红霉素;发酵培养基;磷酸氢二钾;磷酸二氢钾

    中图分类号：R978.1+5? ? ? ? 文献标识码：A? ? ? ? 文章编号：1007-273X（2020）12-0005-03

    红霉素是临床上被广泛用于治疗革兰氏阳性菌感染的十四元大环内酯类广谱抗生素，最早是在1952年从土壤中的红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中分离得到的次级代谢产物，随后红色糖多孢菌也成为工业上主要生产红霉素的放线菌[1]。红霉素的结构主要由3部分组成，一个十四元的大环即红霉内酯、红霉糖和德安糖，彼此通过O-糖苷键连接。在红色糖多孢菌的发酵液中，主要产物是红霉素A，除此之外还有红霉素B、红霉素 C、红霉素D和少量的红霉素E、红霉素F等副产物。其中红霉素A的抗菌活性最好，红霉素B的生物活性是红霉素A的0.15～0.20倍，而毒性则是其毒性的2倍，红霉素E和红霉素F的生物活性也只有红霉素A的0.100～0.125倍[2，3]。以红霉素A为前体合成的第二、三代红霉素衍生物己被广泛应用于临床，主要用于治疗革兰氏阳性细菌的感染[4]。目前国内生产的红霉素产量普遍偏低，据有关报道，国外的红霉素发酵生产水平已达8 000～12 000 U/mL，而国内的发酵水平一般在4 000～5 000 U/mL[5]。因此，对于红霉素发酵水平效价提高的研究迫在眉睫。

    微生物在生长繁殖过程中需要碳源、氮源、磷源、生长因子、无机盐、水分6大营养物质，其中磷是抗生素发酵培养基中的重要营养来源，对抗生素菌体生长和抗生素的合成有很大的影响。不同种类的磷源对抗生素的产量有密切关系[6]。发酵培养基中磷的来源可以分为有机磷源和无机磷源，有机磷源主要是黄豆饼粉、玉米浆等，无机磷源主要是磷酸盐的化合物。发酵前期菌丝的生长和发酵单位的增长主要依靠无机磷的作用，而发酵后期促进菌体合成产物主要依靠有机磷的帮助。培养基中增加无机磷的配比可以提高菌体的代谢速度、促进发酵液含固量增长，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等。目前红色糖多孢菌发酵培养过程的培养基主要组成成分是淀粉、黄豆饼粉、糊精和葡萄糖，组分中缺少无机磷源的供给。考虑到磷调控在次级代谢产物合成过程中的作用，本研究通过增加磷源物质磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，调节两者的比例，使其达到合适的浓度，保证发酵液中的无机磷源含量，给菌体提供合适的磷源。

    1? 材料與方法

    1.1? 菌株

    红色糖多孢菌SPH001，宁夏泰瑞制药股份有限公司实验室保存的工程菌株。

    1.2? 培养基

    斜面培养基：淀粉15 g/L，氯化钠4 g/L，硫酸铵3 g/L，碳酸钙3 g/L，玉米浆12 g/L，琼脂粉2.5 g/L，pH 6.95～7.05。

    种子培养基：蔗糖35 g/L，硫酸铵4 g/L，玉米浆20 g/L，碳酸钙5.6 g/L，pH 6.45～6.65。

    发酵培养基：淀粉25 g/L，黄豆饼粉30 g/L，糊精35 g/L，硫酸铵0.24 g/L，葡萄糖20 g/L，碳酸钙5 g/L，豆油8 g/L，pH自然。

    1.3? 仪器

    高效液相色谱仪，岛津企业管理（中国）有限公司;722分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司;电子分析天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司;高速离心机，深圳天溯计量检测股份有限公司;pH计，PHS-25型，上海仪分科学仪器有限公司。

    1.4 培养方法

    斜面孢子培养：用铲子刮取原始菌株的孢子，蒸馏水稀释后，取200 μL均匀涂至茄瓶斜面上，置于温度33～35 ℃，相对湿度30%～50%培养6～7 d，4 ℃保存使用。

    种子培养：取出保存的茄瓶斜面，铲取1 cm×1 cm大小的斜面孢子接入30 mL的种子培养基中，置于摇瓶机上培养42～43 h，培养温度为30～33 ℃，相对湿度30%～50%，摇瓶机转速为220 r/min。

    发酵培养：取培养好的种子液1 mL转入30 mL的发酵培养基中，置于摇瓶机上培养144～168 h，培养温度为30～33 ℃，相对湿度30%～50%，摇瓶机转速为220 r/min。

    1.5? 分析方法

    pH的测定：发酵培养一定周期后，使用pH计对发酵液的pH进行检测。

    菌浓的测定：取10 mL离心管称管重，再称取发酵培养液10 g于10 mL的离心管中，5 000 r/min离心10 min，倒掉上清烘干并称量沉淀的重量，菌体浓度=（沉淀重量-管重）×100%。

    化学效价的测定：采用硫酸水解法进行测定，取培养好的发酵液10 mL离心，吸取1 mL上清液至9 mL K2CO3溶液及10 mL乙酸丁酯的比色管中，密塞摇瓶30 s后静止至分层，吸取5 mL乙酸丁酯相加入至含有10 mL 0.1 mol HCl的分液漏斗中，密塞振摇30 s后静止至分层，吸取5 mL下层溶液沿管壁加入至含有3 mL浓硫酸的干燥试管中，缓慢晃动试管至显色后再加力摇匀，放置冷却至室温，紫外分光光度计于498 nm处检测液体的吸光度，根据标准曲线计算溶液的化学效价。

    各组分的测定：发酵液离心取上清，加入甲醇5倍稀释后，5 000 r/min离心10 min，取上清液使用高效液相色谱仪进行检测。色谱条件为：Waters XBridge^TM C18（250 mm×6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH 7.00，35∶30∶35），流速为1.0 mL/min，检测波长为498 nm，柱温为35 ℃，进样量为40 μL。根据各组分的峰面积值计算其效价。

    2? 结果与分析

    2.1? 添加磷酸氢二钾和磷酸二氢钾对种子液的影响

    种子培养基中分别添加浓度为4、8、10、12、14 g/L的磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，配方比例见表1，种子液培养42 h后，检测其pH和菌体浓度，结果如图1所示，2种磷源浓度在4～14 g/L对种子液的pH不会产生太大影响，但是菌体浓度却有所改变。当磷酸氢二钾浓度为4 g/L和8 g/L，菌体浓度明显升高，表明在种子培养基中加入适当浓度磷酸氢二钾能促进菌体代谢。

    2.2? 添加磷酸氢二钾和磷酸氢二钾对发酵液的影响

    为了进一步验证2种磷源对红霉素工程菌发酵过程的影响，将磷酸氢二钾和磷酸二氢钾以4、8、10、12、14 g/L的配比添加在红霉素发酵培养基中进行单因素试验考察，配方比例见表2。每种配方做3个平行试验，对发酵液进行pH、菌体浓度和效价的检测取平均值，结果见图2。由图2可知，发酵液中添加磷酸氢二钾配比为4 g/L和8 g/L时，能明显提高菌体浓度，摇瓶效价亦从6 293 U/mL升高至7 560 U/mL。而添加磷酸二氢钾为4 g/L时发酵液菌体浓度和效价没有明显改变，为8 g/L时菌体浓度和效价开始下降。当继续增大2种磷源浓度时，菌体浓度逐渐呈现下降趋势，效价也随之下降。由于无机磷能增加菌体代谢速度，促进菌体生长，使得添加少量的无机磷源发酵单位也随之增长。但是磷源过高会使氮磷比例失衡，打破菌体的代谢平衡，导致菌体代谢缓慢，发酵单位也随之下降。磷酸二氢钾溶解使发酵液呈酸性，而酸性条件不利于红霉素菌体的代谢生长，故使得摇瓶发酵产生红霉素的量愈来愈低。

    2.3? 含磷源培养基配比的确定

    根据单因素试验对培养基中添加磷源所进行的研究，最终确定在发酵液培养基中添加4～8 g/L的磷酸氢二钾。进一步考察淀粉、黄豆饼粉、糊精和磷酸氢二钾的最优配比。得到一个合适的发酵液培养基配方，各因素水平见表3。采用L9（34）进行正交试验，确定最优培养基配比，结果见表4。由表4可知，马铃薯淀粉、黄豆饼粉、糊精和磷酸氢二钾4种因素对发酵水平的影响程度排序为A>D>B>C，其中最优的培养基搭配方式为A3B3C2D1，即淀粉30 g/L、黄豆饼粉30 g/L、糊精30 g/L、磷酸氢二钾8 g/L。

    3? 讨论

    本试验探讨了2种无机磷源（磷酸氢二钾和磷酸二氢钾）对红色糖多孢菌培养过程产生红霉素的影响，发现添加适当浓度磷酸氢二钾对红色糖多孢菌的生长可产生促进作用，当磷酸氢二钾浓度为8 g/L，种子液和发酵液中菌体浓度都会明显升高，效价也相应提高至7 560 U/mL，当浓度不断增大至10、12、14 g/L时，菌种的生长受到抑制，代谢减弱，菌体浓度下降，效价降低。由此可知，培养基中添加适当浓度磷酸氢二钾在红霉素的发酵过程中发挥着重要的作用。

    为了使培养基中碳源、氮源和磷源的搭配达到一个合适的配比，本试验进一步采用正交法对发酵液的培养基进行了相应的优化。结果表明，淀粉、糊精和黄豆饼粉对红霉素的效价有显著性影响[7]，淀粉和糊精作为速效碳源，易被菌体利用，促进菌体的生长代谢[8]，黄豆饼粉是抗生素发酵工业中主要的有机氮源，特别是在红霉素发酵过程中扮演着十分重要的角色[9]，在发酵前期，黄豆饼粉可以作为菌体生长所需的碳骨架[10]，在发酵中后期，它可以提供菌体所需的氨基酸。因此，在发酵液培养基组成中，重点优化了淀粉、黄豆饼粉、糊精以及磷酸氢二钾4种发酵液组分，结果表明，淀粉对红霉素效价的影响最大，其次是糊精、磷酸氢二钾和黄豆饼粉，当4种组分的搭配比例分别为30、30、30、8 g/L时效价提高至7 910 U/mL，较未优化时提高4.6%。

    综上所述，8 g/L的磷酸氢二钾能提高红色糖多孢菌产红霉素的效价，同时在发酵液的主要影响组分达到合适配比的情况下，效价亦得到提高，为进一步研究红霉素培养基组成优化奠定了基础。

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