禽腺病毒Ⅰ群分离、鉴定方法

    杨作丰

    摘要：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）是一种双链DNA病毒，病毒对外界环境耐受较强，并有水平传播及垂直传播两种传播方式，近年来在国内呈暴发式流行，各地养殖场均有报道检测到FAV-Ⅰ，FAV-Ⅰ对养殖业造成严重损失。分离、鉴定FAV-Ⅰ的毒株类型是防控此病的基础。除传统的检测方法外，近年新兴了多种检测技术，对这些分离、鉴定方法进行了概述。

    关键词：禽腺病毒Ⅰ群；分离；鉴定

    中图分类号：S858.3 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2017）02-0005-03

    近年来禽腺病毒病在我国发病率日益升高，给养殖业造成巨大损失。感染禽腺病毒的家禽21 d内死亡率高达30%，禽腺病毒病的防治成为迫要需要解决的问题[1]。禽腺病毒是一种DNA病毒，能够引起鸡群禽腺病毒感染，是一种亚临床性传染病，感染鸡群通常为症状不明显的隐性感染，并长期带毒[2]。根据病毒群特异性抗原的不同将其分为三群：禽腺病毒Ⅰ群（FAV-Ⅰ）、禽腺病毒Ⅱ群、禽腺病毒Ⅲ群。FAV-Ⅰ主要包括传统的腺病毒以及从其他禽类分离出的腺病毒分离株，这些腺病毒毒株具有相同的抗原群；禽腺病毒Ⅱ群主要是包括火鸡出血性肠炎及鸡大脾病毒，这些病毒具有和FAV-Ⅰ不同的抗原群；禽腺病毒Ⅲ群主要是产蛋综合征相关的病毒。

    据报道FAV-Ⅰ能引起心包涵体炎、心包积水-肝炎综合征等传染病[3]。FAV-Ⅰ病毒可分为A、B、C、D、E、F五个种和12个血清型[4]。禽腺病毒的潜伏期较短，鸡日龄越小越易感染FAV-Ⅰ，成年鸡也可感染，通常没有明显症状但是能够作为混合感染时的条件性病原，在一定条件下部分禽腺病毒也能够作为原发性病原，引发禽类的多种病症[5]。禽腺病毒能够通过鸡的排泄物排出，正常鸡接触后极易感染，并且禽腺病毒还能通过蛋垂直传播。报道称FAV-Ⅰ对宿主具有高度的特异性，只有少数的病毒能够感染宿主以外的动物。FAV-Ⅰ对外界环境的耐受较强，在室温中依然能够维持毒价长达半年，对酸和热的耐受也很强，因此其经过动物胃肠道依然可以保持活性，这使得其危害更加严重[6-7]。因此FAV-Ⅰ病毒群的分离、鉴定更具有指导意义，本文对常用的FAV-Ⅰ分离、鉴定方法进行了概述。

    1 分离方法

    禽腺病毒的分离通常是通过接种SPF鸡胚来分离、增殖。接种位置有两种，分别是卵黄囊接种及绒毛尿囊膜接种，接种鸡胚后病变主要出现在肝脏部位，肝脏呈重度充血、出血及严重的弥漫性变性、坏死。卵黄囊、肾脏、脾脏也有一定的变性、坏死[8]。

    1.1 病料直接分离法

    无菌操作取发病鸡肝脏，按照1∶5（W/V）的比例加入灭菌后的生理盐水，于操作台中研磨，生理盐水中预先加入双抗（青霉素2 000 U/mL；链霉素2 000 μg/mL）。充分研磨后，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min后取上清液，经0.22 μm的滤器过滤除菌，过滤液经无菌检验后，卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每日照蛋两次，弃掉3 d内死掉的鸡胚，收获4～10 d死亡的鸡胚的尿囊液，盲传检验所收获病毒液，合格后冷冻保存。

    1.2 棉拭子分离法

    取病鸡口腔及肛门拭子，用适量的生理盐水浸泡拭子2 h，充分浸泡棉拭子后，反复冻融3次，3 000 r/min离心15 min，取上清液经0.22 μm滤器除菌，经无菌检验后卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚，每日照蛋两次，弃掉3 d内死掉的鸡胚，收获4～10 d死亡的鸡胚的尿囊液，盲传检验所收获病毒液，合格后冷冻保存。

    2 鉴定方法

    禽腺病毒的鉴定方法有很多种，分别为免疫琼脂扩散试验、中和试验、电子显微镜法、PCR反应鉴定、酶联免疫吸附试验（ELISA）鉴定、环介导的等温扩增技术（LAMP）、交叉引物扩增技术（CPA）等，每种方法都有其优缺点，根据实际要求选择合适的方法进行鉴定，现对其中几种实验室常用方法进行概述。

    2.1 免疫琼脂扩散试验

    根据沉淀试验原理，抗原、抗体在琼脂中扩散，相遇后可结合形成抗原-抗体复合物，外观呈一条白色沉淀线。应用免疫琼脂扩散试验鉴定FAV-Ⅰ病毒是一种血清学诊断技术，该方法具有操作简便、快捷、灵敏度高等特点，将病毒分离、纯化，用作免疫琼脂扩散试验的抗原，称取一定量的琼脂粉，按照1%浓度加入生理盐水，加热充分溶解，将溶解的琼脂溶液倒入平皿中，冷却，选择合适打孔器进行打孔，挑出孔内琼脂，小心加热平皿底部使孔底琼脂融化少许，起到封底的作用。加入阳性血清和所制备的抗原，倒置放置在湿盘中，37 ℃自由扩散24～48 h观察结果，看是否观察到白线，如果有则证明此抗原是FAV-Ⅰ[9]。

    2.2 电镜检测鉴定

    根据腺病毒的特征形态，该病毒为球形、无囊膜、二十面体对称、直径约为80 nm。可以直接用电子显微镜观察病毒形态，看是否吻合进行初步确定。也有报道称禽腺病毒可以用电镜负染法鉴定，用适量的水重悬病毒粒子，在载玻片上以1%磷钨酸负染30 s，包埋于200目聚乙烯醇缩甲醛铜网上，用电子显微镜观察病毒粒子形态，看是否与禽腺病毒吻合[10]。

    2.3 PCR方法鉴定

    FAV-Ⅰ能够在细胞核内复制，产生嗜碱性包涵体，其结构蛋白主要是Hexon蛋白，含有特异性抗原决定簇，能够中和抗体，是病毒的一种保护基因，与病毒的致病性密切相关[11]。FAV-Ⅰ病毒有12个血清型，其中最具有代表性的病毒为鸡胚致死孤儿病毒（CELOV），许多学者应用PCR鉴定时会选择Hexon基因或CELOV的序列进行引物设计[12]。也有报道根据Hexon loop1基因及特意纤维蛋白原基因的同源性分析，可以将不同种的腺病毒进行进一步的分离鉴定，分析各种毒株的亲缘性关系，对疾病的防控起到了积极作用[13]。

    PCR方法鑒定是常用的检测手段，根据GenBank中公布的病毒的全基因组序列的保守区设计引物。无菌取病鸡内脏研磨，将研磨液8 000 r/min离心后取上清液，提取其中的病毒DNA作为模板，加入酶、引物等。琼脂糖凝胶电泳检测是否有目的条带。用琼脂凝胶回收试剂盒将目的条带回收纯化，测序。将测序结果用NCBI中的Nuclear acid blasting进行序列比对，确定是否为FAV-Ⅰ感染[14]。

    也有研究[14]将套式PCR应用到鉴定中，套式PCR具有敏感性高、特异性强、快速、高效等特点。方法是根据GenBank中FAV-Ⅰ病毒的基因设计两对引物，第一对引物扩增片段和普通PCR相似，第二对引物（巢氏引物）应在第一次PCR产物内部。这样经过两次PCR反应后，根据目的条带判断所检测病毒是否为FAV-Ⅰ病毒。

    2.4 ELISA方法鉴定

    酶联免疫吸附试验是在不影响酶活性的条件下，令酶分子与免疫球蛋白相结合，由标记酶的放大作用，确保了ELISA反应的灵敏性[15]。FAV-Ⅰ病毒的主要结构蛋白是六邻体蛋白，是该病毒粒子中含量最高的一种蛋白，含有240个壳粒，占了FAV-Ⅰ病毒全部壳粒的90%以上。了解六邻体衣壳蛋白特性具有非常大的研究价值，无论是灭活疫苗制备还是ELISA抗原蛋白的制备[16]。100 K蛋白、33 K蛋白是FAV-Ⅰ的非结构蛋白，在病毒感染的过程中起到了关键的作用，并且在鉴定的时候这两种蛋白具有更高的敏感性及特异性，使检测结果更加准确[17]。罗丝丝[18]建立了一种简便、快速的检测FAV-Ⅰ抗体的间接ELISA方法，构建pGEX-penton质粒，转入大肠杆菌DH5α，诱导表达、纯化。利用表达和纯化产物作为抗原，同时优化了反应条件，成功建立FAV-Ⅰ间接penton-ELISA检测方法。Junnu等[19]利用大肠杆菌表达纯化禽腺病毒中的六邻体蛋白而研究出一种新的、快速的ELISA检测试剂盒。

    2.5 LAMP鉴定方法

    LAMP技术是一种新的恒温核酸扩增技术，该技术具有特异性强、灵敏度高、操作简单等优点，该技术已经被应用到多种病原微生物的检测，如大肠杆菌、沙门氏菌、分枝杆菌、副溶血性弧菌等[20]。唐熠等[21]根据Ⅰ群禽腺病毒的Hexon基因的保守序列设计了一套特异性环介导等温扩增的引物，从而建立了一种适用于Ⅰ群禽腺病毒的LAMP快速的检测手段，该方法简便、快速、敏感性强、特异性高。

    2.6 CPA鉴定方法

    CPA是完全由中国优思达公司独立研发成功的一种新的核酸恒温扩增技术，也是中国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术，CPA与其他技术相结合是现在一个完整的快速分子检测技术平台，目前CPA对禽腺病毒检测的应用才刚刚开始，据报道称CPA检测禽腺病毒hexon基因已经研发出来[22]，这将是比PCR技术更加快速、更加便宜的一项检测技术。

    3 展望

    FAV-Ⅰ是近年危害较大的一种常见禽流行病，对养殖业造成较大损失，引起畜牧工作者较多关注，越来越多的分离、鉴定方法被应用到检测FAV-Ⅰ上。除本文上述常规、成熟检测方法外，多种快捷、简便且精准度更高的检测方法，如I群腺病毒定向靶位检测、腺病毒跨群定型检测等也逐渐成为研究的热点。随着对检测方法的不断深入研究，将为腺病毒检测及综合防控提供基础保障。

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