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二甲双胍对脂肪前体细胞增殖和分化的影响

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车选强宗琦赵冉赵淑淼

【摘要】目的研究不同濃度二甲双胍对3T3-L1脂肪前体细胞的增殖和分化的影响。方法将体外培养的3T3-L1脂肪前体细胞用不同浓度的二甲双胍处理。分别采用倒置显微镜观察细胞形态、MTT法、油红0染色法、酶标仪测量光密度值等方法研究不同浓度二甲双胍对3T3-L1脂肪前体细胞增殖、分化的影响。结果在镜下观察3T3-L1脂肪前体细胞细胞贴壁后呈成纤维细胞样，当二甲双胍组浓度较低（≤0.5 mmol/L）时，其细胞的形态、密度、各组光密度值无明显差异，当二甲双胍组浓度较高（≥5 mmol/L）时，细胞出现变形、破坏，甚至形成凋亡小体，细胞数量也减少，各组光密度值存在统计学差异。油红0染色后显微镜下观察细胞的形态，阴性对照组细胞呈成椭圆形或梭形;阳性对照组、二甲双胍浓度较低（≤0.5 mmol/L）组可见80%～90%的细胞向脂肪细胞分化，细胞内见大量脂滴聚积，油红0染色明显着色，其光密度值与阴性对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），与阳性对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。二甲双胍浓度为5 mmol/L组脂肪细胞表型数量、油红0染色着色较对照组显著减少，其光密度值与阳性对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论二甲双胍浓度较低（≤0.5 mmol/L）时对3T3-L1脂肪前体细胞增殖无影响;二甲双胍浓度较高（≥5 mmol/L）时3T3-L1脂肪前体细胞的增殖可明显被抑制，且随着药物的浓度增加抑制作用增强;二甲双胍浓度较高（≥5 mmol/L）可能促进3T3-L1脂肪前体细胞的凋亡。低浓度的二甲双胍（≤0.5 mmol/L）对3T3-L1脂肪前体细胞的分化无影响;3T3-L1脂肪前体细胞的分化可被5 mmol/L的二甲双胍抑制。

【关键词】二甲双胍;3T3-L1脂肪前体细胞;细胞增殖;细胞分化

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.31.104

The effect of metformin on the proliferation and differentiation of preadipocyte ? CHE Xuan-qiang， ZONG Qi， ZHAO Ran， et al. Department of Endocrinology， Jinan 5th Peoples Hospital， Jinan 250022， China

【Abstract】 Objective ? To study the effect of metformin at different concentrations on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. Methods ? 3T3-L1 preadipocyte cultured in vitro were processed with metformin at different concentrations. Cell morphology was observed by inverted microscope. The effects of metformin at different concentrations on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocyte was observed by MTT method， oil red O staining method， microplate reader measuring optical density value method. Results ? Microscopic observation of 3T3-L1 adipose precursor cells showed fibroblast-like appearance after adherence. When the concentration of metformin group was lower （≤0.5 mmol/L）， there was no significant difference in cell morphology， density and optical density between groups. When the concentration of metformin group was higher （≥5 mmol/L）， the cells were deformed， destroyed， even formed apoptotic bodies， and the number of cells decreased， and the optical density of each group had statistical difference. After oil red 0 staining， the cells in negative control group were oval or spindle-shaped. In positive control group and metformin group with lower concentration （≤0.5 mmol/L）， 80%～90% of the cells differentiated into adipocytes， and a large number of lipid droplets accumulated in the cells. Oil red 0 staining was obvious colored. Compared with the negative control group， the difference of optical density was statistically significant （P<0.05）， and there was no significant difference in optical density between the positive control group and the negative control group （P>0.05）. In metformin?5 mmol/L concentration group， the number of phenotypes and oil red 0 staining of adipocytes were significantly less than those of the control group. The optical density was statistically significant with the positive control group （P<0.05）. Conclusion ? Low metformin concentration （≤ 0.5 mmol/L） had no effect on the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte. The proliferation of 3T3-L1 preadipocyte was significantly inhibited when metformin concentration was higher （≥ 5 mmol/L）， and the inhibition increased with the increase of metformin concentration. Higher concentration of metformin （≥ 5 mmol/L） may promote apoptosis of 3T3-L1 preadipocyte. Low concentration of metformin （≤0.5 mmol/L） had no effect on the differentiation of 3T3-L1 preadipocyte. The differentiation of 3T3-L1 preadipocyte could be inhibited by 5 mmol/L metformin.

【Key words】 Metformin; 3T3-L1 preadipocyte; Cell proliferation; Cell differentiation

近年来随着人类生活水平的提高及生活方式的转变，肥胖的发病率逐年增高，并可引起严重的并发症，如2型糖尿病、高血压病、呼吸睡眠暂停综合征等[1]，已经被世界卫生组织评定为危害人类健康的第5大因素[2]。在肥胖症的发生、发展过程中脂肪组织起着重要的作用。研究证实，脂肪前体细胞的增殖和分化与肥胖密切相关 [3]。脂肪前体细胞过多的分化及脂肪细胞的肥大均可诱导肥胖的发生[4]。脂肪前体细胞除分化外，还可能面临凋亡。二甲双胍一直作为治疗2型糖尿病的一线用药，除了具有降血糖作用以外，还体现在心血管保护和减轻体重[5]，改善胰岛素抵抗方面。但是二甲双胍能减轻体重的机制目前尚不明确。通过改变脂肪前体细胞的分化、凋亡而调节脂肪重新分配可能会改善腹型肥胖的问题[6]。二甲双胍对脂肪前体细胞增殖、分化、凋亡有无影响，目前报道较少。因此本实验主要研究二甲双胍对3T3-L1脂肪前体细胞增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1. 1 材料来源二甲双胍购于中美上海施贵宝制药有限公司;3T3-L1脂肪前体细胞购自于美国模式培养物集存库;二甲基亚砜购于Amresco公司;DMEM（Dulbeccos Modified Eagle Medium， DMEM）培养基、胎牛血清购于Hycolone公司;0.25%胰酶-EDTA（Ethylene Diaminetetraacetic Acid， EDTA）、双抗、PBS（Phosphate Buffered Saline， PBS）缓冲液购于Gibco公司;牛胰岛素、3-异丁基-1甲基黄嘌呤、地塞米松、油红0、噻唑蓝购于Sigma公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞培养第3代美国模式培养物集存库的3T3-L1脂肪前体细胞（用25 cm培养瓶装;高糖DMEM中含10%的胎牛血清、1%的双抗）在温度为37℃、饱和湿度5% CO2体积分数的培养箱中进行体外静置培养，当细胞生长至大约70%～80%融合时进行细胞传代。

1. 2. 2 MTT法检测细胞增殖打开超净工作台，将3T3-L1脂肪前体细胞铺到96孔培养板中，每孔加100 μl培养液，细胞密度为5000个/孔。将接种细胞的42个孔共分为7组（每组6个副孔）。培养24 h当细胞融合约70%时，实验组加入0.05、0.5、5、10、20、50 mmol/L浓度的二甲雙胍，实验组换上含不同二甲双胍浓度的基础培养液，对照组换上所加药物等体积的PBS（二甲双胍浓度为0 mmol/L）的基础培养液，培养48 h，倒置显微镜下观察细胞形态和数量。每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml，即为0.5%MTT），继续培养4 h后，吸去孔内的培养液，并在每孔中分别加入200 μl 的DMSO，放置在恒温振荡器上振荡10 min，当看到结晶物质充分溶解。酶标仪测定在570 nm处的吸光度。

1. 2. 3 油红O染色法检测细胞分化打开超净工作台，把3T3-L1脂肪前体细胞铺到24孔培养板中，分别在每孔中加1 ml基础培养液，细胞密度为50000个/孔;设4个副孔;并设立阴性对照组（基础培养液1 ml，不加诱导液， PBS 50 μl，无二甲双胍），阳性对照组（诱导分化液Ⅰ1 ml， PBS 50 μl，无二甲双胍），实验组（诱导分化液Ⅰ1 ml， 0.05、0.5、5 mmol/L浓度的二甲双胍），当3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化至第10～12天，可见80%～90%的细胞分化成为脂肪细胞，在显微镜下可观察到明显脂滴形成。吸去孔内的培养液，用PBS清洗一次残余培养液，每孔加1 ml新鲜配制的油红O工作液，室温作用10 min后弃去油红0染料，然后再用60%异丙醇漂洗1 min，去除背景着色后放置在显微镜下仔细观察脂滴形成。每孔分别加入200 μl 异丙醇，放置于37℃作用10 min，吸取脱色后的液体，然后移入96孔板中，酶标仪测定在510 nm处的吸光度。

1. 3 统计学方法采用SPSS18.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示，采用单因素方差分析进行组间均数比较，两两进行比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 二甲双胍以浓度依赖性抑制3T3-L1脂肪前体细胞的增殖显微镜下观察3T3-L1脂肪前体细胞贴壁后呈成纤维细胞样，在体外进行培养24 h后，对照组， 0.05 mmol/L和0.5 mmol/L三组在显微镜下观察，细胞形态和细胞密度无明显差异，而5、10、20和50 mmol/L的二甲双胍组和对照组相比，显微镜下细胞形态明显发生了改变（包括变形、破坏，甚至形成凋亡小体），细胞的数量也显著减少，且破坏的程度随着二甲双胍浓度的增加而增加，细胞数量也随二甲双胍浓度的增加而越少。继续进行培养至72 h时，亦呈上述结果。见图1。用不同浓度的二甲双胍对3T3-L1脂肪前体细胞的增殖过程干预72 h，用MTT法在酶标仪570 nm处并测定各组的光密度值。结果发现对照组和0.05、0.5、5、10、20、50 mmol/L各组OD570的值分别为（2.13±0.14）、（2.00±0.09）、（1.98±0.09）、（1.53±0.20）、（1.29±0.14）、（1.03±0.12）、（0.71±0.15）。3T3-L1脂肪前体细胞增殖受到明显抑制，且抑制效应呈浓度依赖性（P<0.01）;5、10、20和50 mmol/L不同浓度的二甲双胍各组之间比较，差异均具有统计学意义（P<0.05），二甲双胍药物浓度越增加，其光密度值越小。见表1。

2. 2 二甲双胍以浓度依赖性抑制3T3-L1脂肪前体细胞的分化 3T3-L1脂肪前体细胞接种到24孔培养板中诱导分化12 d，并设立三组：阴性对照组、阳性对照组和实验组，在实验组开始加诱导液时，用不同浓度的二甲双胍进行干预。结果①阴性对照组细胞未向脂肪细胞分化，呈梭形或椭圆形，用油红0染色后着色不明显。②阳性对照组中见80%～90%的向脂肪细胞分化，可见脂滴，用油红0染色后着色明显。③0.05 mmol/L二甲双胍组和0.5 mmol/L二甲双胍组亦可见80%～90%的细胞向脂肪细胞分化，可见脂滴聚积，用油红0染色后着色明显，和阳性对照组无差别。④5 mmol/L的二甲双胍组中向脂肪细胞分化的细胞数量和对照组相比明显减少，油红0染色后着色也明显减少。见图2。当3T3-L1脂肪前体细胞被诱导分化12 d后，应用油红0染色法在酶标仪510 nm处测定各组光密度值。结果发现阴性对照组、阳性对照组及0.05、0.5、5 mmol/L各组OD510的值分别为（0.34±0.02）、（0.61±0.06）、（0.59±0.05）、（0.59±0.05）、（0.42±0.03）。发现与阴性对照组相比，阳性对照组、含不同浓度二甲双胍组的3T3-L1脂肪前体细胞分化受到明显抑制，且抑制效应呈浓度依赖性（P<0.01）。0.05、0.5 mmol/L二甲双胍组和阳性对照组相比较，差异均无统计学意义（P>0.05），而5 mmol/L二甲双胍组和阳性对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）;5 mmol/L二甲双胍和0.05、0.5 mmol/L二甲双胍组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见表2。

3 讨论

美国内分泌医师协会将肥胖症定性为一种疾病[7]，肥胖症已成为人们必须积极干预的健康问题。它会增加糖尿病、代谢综合症、心脑血管疾病的发生风险[8]。脂肪细胞的数量是由具有多向分化潜能的间充质干细胞在适当刺激下分化而成[9]。脂肪细胞的体积是由脂肪前体细胞向成熟脂肪细胞分化的程度所决定的[10]。分化程度越高，体积越大。因此脂肪细胞的异常增殖分化可引起肥胖。

二甲双胍是目前临床上应用最广的降糖药物，其降糖的主要机制包括抑制肝脏葡萄糖的异生、促进糖原分解，减少肝脏糖原的输出，抑制葡萄糖的吸收，促进外周组织充分利用葡萄糖;改善组织对胰岛素的敏感性并增加胰岛素与外周组织中胰岛素受体亲和力[11]。抑制二肽基肽酶IV（DPP4），从而提高胰高血糖素样肽（GLP-1）浓度[12]，减少脂肪合成，改善胰岛素抵抗[13]。二甲双胍对肥胖患者（无论其是否合并2型糖尿病）均有显著的降低体重的作用[14， 15]，但二甲双胍减轻体重的作用机制目前尚不明确。因此本研究主要探究不同浓度二甲双胍对脂肪前体细胞的影响。

二甲双胍有减轻体重的作用，但机制目前仍未完全阐明。可能的机制包括：①二甲双胍通过改善瘦素和肿瘤坏死因子（TNF-α）的抵抗状态[16]，以抑制胞内的脂质积聚来延缓肥胖的发展。②二甲双胍对食欲有抑制作用[17]，从而达到减重作用。③改善高胰岛素血症并降低基础胰岛素及负荷后胰岛素水平[17]。④二甲双胍能抑制前体脂肪细胞内脂质累积并降低成脂基因PPARγ和C/EBP a 表达[18]。

通过实验虽然证实了高浓度的二甲双胍能抑制脂肪前体细胞的增殖和分化，但正常血药浓度的二甲双胍对脂肪前体细胞增殖和细胞分化并无影响。在本实验中应用二甲双胍干预脂肪前体细胞的时间比较短，如果在体内长期应用正常血药浓度二甲双胍，是否会对脂肪前体细胞的细胞增殖和细胞分化产生还需进一步研究证实。此外，流行病学调查资料提示二甲双胍还可以降低某些肿瘤的发病率和病死率[19]，其可能機制为激活LKBI/AMPK通路[20]，从而诱导某些肿瘤细胞的细胞周期停滞以及诱导细胞凋亡[21]。这从侧面提示，假如二甲双胍在体内能够诱导或促进脂肪前体细胞的凋亡，这可能会成为二甲双胍减轻体重一个重要机制。本实验应用不同浓度的二甲双胍对脂肪前体细胞的增殖进行干预，发现用高浓度（≥5 mmol/L）的二甲双胍对脂肪前体细胞的增殖过程进行干预后，镜下观察细胞的数量明显减少，且有凋亡小体的出现，提示二甲双胍可能促进脂肪前体细胞的凋亡，但二甲双胍真正能否促进脂肪前体细胞的凋亡以及可能的作用机制还需要进一步研究。

综上所述，二甲双胍浓度较低（≤0.5 mmol/L）时对3T3-L1脂肪前体细胞增殖无影响;二甲双胍浓度较高（≥5 mmol/L）时3T3-L1脂肪前体细胞的增殖可明显被抑制，且随着药物的浓度增加抑制作用增强;二甲双胍浓度较高（≥5 mmol/L）可能促进3T3-L1脂肪前体细胞的凋亡。低浓度的二甲双胍（≤0.5 mmol/L）对3T3-L1脂肪前体细胞的分化无影响;3T3-L1脂肪前体细胞的分化可被5 mmol/L的二甲双胍抑制。

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[收稿日期：2019-08-28 ]

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