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标题 槐耳板蓝根双向发酵提取物抑制乳腺癌MCF—7细胞迁移/侵袭及相关因子的研究
范文 周蓉蓉 高鹏飞 张文意 张艳聪 马维维 刘秋雨 史新元 连增林



摘要：目的 观察槐耳板蓝根双向发酵产物对乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭和相关因子的影响，探讨其相关机制。方法 以人乳腺癌MCF-7细胞为模型，实验分为对照组、板蓝根组、槐耳组和槐耳板蓝根组。MTT法检测细胞增殖；细胞划痕实验检测MCF-7细胞迁移能力；Transwell细胞侵袭实验检测MCF-7细胞侵袭能力；细胞黏附实验检测MCF-7细胞黏附能力；半定量RT-PCR检测MCF-7细胞基质金属蛋白酶（MMP-9）和波形蛋白（Vimentin）基因表达。结果 与板蓝根组和槐耳组比较，槐耳板蓝根组明显抑制MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和黏附（P<0.05），抑制MMP-9和Vimentin的基因表达（P<0.05）。结论 槐耳板蓝根双向发酵提取物可能通过下调MMP-9和Vimentin的基因表达抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移、侵袭。
关键词：槐耳；板蓝根；双向发酵；乳腺癌；迁移；侵袭；基质金属蛋白酶；波形蛋白
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）05-0064-05
Effects of Trametes Robiniophila Murr and Isatidis Radix Bidirectional Fermentation Products on Migration/Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells and Relevant Factors ZHOU Rong-rong1， GAO Peng-fei1， ZHANG Wen-yi1， ZHANG Yan-cong1， MA Wei-wei1， LIU Qiu-yu1， SHI Xin-yuan1， LIAN Zeng-lin2 （1. School of Pharmaceutical Sciences， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2. Beijing Handian Academy of Chinese Medicine， Handian Group， Beijing 100103， China）
Abstract： Objective To observe the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells and relevant factors； To discuss relevant mechanism of action. Methods Breast carcinoma cell line MCF-7 was used as research subject in this experiment. Control group， Isatidis Radix group， Trametes robiniophila Murr group， and Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix group were included in the experiment. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on MCF-7 cell proliferation were measured by MTT method. Cell scratch assay， transwell assay and adhesion assay were used to measure the effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells， respectively. The effects of Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products on the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin were measured by RT-PCR. Results Compared with Isatidis Radix group and Trametes robiniophila Murr group， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products could significantly inhibit the proliferation， migration， invasion and adhesion capability of MCF-7 cells （P<0.05）. Similarly， Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products reduced the mRNA expression of MMP-9 and Vimentin （P<0.05）. Conclusion Trametes robiniophila Murr and Isatidis Radix bidirectional fermentation products may down-regulate the expression of MMP-9 and Vimentin to inhibit the migration， invasion and adhesion capabilities of MCF-7 cells.
Key words： Trametes robiniophila Murr； Isatidis Radix； bidirectional fermentation； breast cancer； migration； invasion； MMP-9； Vimentin
基金项目：北京市科技新星计划交叉学科项目（xxhz201210）
通讯作者：史新元，E-mail：xyshi@126.com；连增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com
槐耳板蓝根双向发酵产物是基于20世纪80年代庄毅教授创立的现代中药新型双向发酵技术研制而成[1]。槐耳菌适应性广泛，在发酵过程中可产生丰富的次生代谢产物，具有较好的辅助抗肿瘤作用[2-5]。板蓝根含有丰富的营养物质，其化学成分基础研究已较为成熟，且其所含化学成分靛玉红已被证实具有提高免疫及抗肿瘤作用[6]。故采用具有一定活性成分的板蓝根作为药性基质，将槐耳和板蓝根作为一对组合开展双向发酵研究，以期发生增强药效的协同作用，获得更好的生物学效应。本课题组前期研究表明，发酵过程中菌质（靛蓝、靛玉红、精氨酸为主成分）薄层斑点随发酵时间呈现规律变化，随着发酵时间的延长，有新的斑点出现[7]。上述结果提示在双向发酵过程中槐耳对板蓝根药材中的化学物质进行了转化，并具有合成新化合物的能力。本研究以人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，分析槐耳板蓝根双向发酵产物对其迁移、侵袭及相关因子的影响。
1 实验材料
1.1 细胞株
人乳腺癌细胞MCF-7，中国科学院上海细胞库。
1.2 药物及制备
槐耳，东北食药真菌研究所。板蓝根，安国市萌露中药饮片有限公司，经北京汉典中医研究院刘晔老师鉴定，符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。槐耳板蓝根双向发酵提取物：采取醇提、水提相结的方法，将槐耳板蓝根双向发酵产物中的药效物质充分提取，最后经干燥制成提取物。
1.3 主要试剂与仪器
胎牛血清（FBS，Hyclone，SH30070.03），0.25%胰蛋白酶（Hyclone，SH40003.01B），MTT（Amresco，0793-5g），二甲基亚砜（DMSO，Amresco，0231），MEM培养液（Hyclone，SH30024.01B），青链霉素混合液（Solarbio，P1400-100），25 cm2细胞培养瓶、96孔细胞培养板、6孔细胞培养板、移液管、Transwell小室（Corning），结晶紫染液（Sigma公司），PCR试剂盒（TaKaRa，RR019A），Matrigel基质胶（BD公司）。
YT-CJ-2ND型超净工作台（北京亚泰科隆仪器技术有限公司），MCO-175 CO2培养箱（SANYO），BDS200倒置相差显微镜（奥特光学），MULTLSKAN MK3酶标仪（Thermo），LXJ-ⅡA型离心机（上海安亭科学仪器厂），BIOMATE型紫外可见分光光度计（Thermo），GE4852型PCR仪（杭州柏恒科技有限公司），JY600电泳仪（北京君意东方电子设备有限公司），ChampGel 5000型全自动凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司），照相机（日本Canon）。
2 实验方法
2.1 MTT法检测细胞增殖作用
MCF-7细胞第3代经胰酶消化，用普通培养液（含10%FBS、1×105 U/L青霉素、100 mg/L硫酸链霉素的MEM培养液）稀释成2.5×104个/mL细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔培养板。细胞培养过夜后进行分组处理：对照组换用普通培养液，药物干预组换用含槐耳、板蓝根及槐耳板蓝根双向发酵提取物培养液各4 mg/mL。每组6个复孔，每孔加入上述培养液200 μL，继续培养48 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内孵育4 h后，弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO，室温下振荡15 min混匀。待沉淀完全溶解后，于酶标仪570 nm处测定光密度（OD）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（OD值空白孔-OD值测量孔）÷（OD值空白孔-OD值调零孔）×100%。
槐耳、板蓝根和槐耳板蓝根双向发酵提取物药液的制备：取槐耳、板蓝根和槐耳板蓝根双向发酵提取物各0.5 g，溶于10 mL无血清MEM培养基液，摇匀，于4 ℃冰箱静置过夜，4000 r/min离心10 min，取上层液于50 mL离心管中，另取10 mL无血清MEM培养基液，对下层沉淀再溶解，4000 r/min离心10 min，取上层液于50 mL离心管中，合并2次溶液，加无血清MEM培养基液至45 mL，另加5 mL FBS，得到10 mg/mL槐耳、板蓝根和槐耳板蓝根双向发酵提取物母液（含10%FBS），0.45 μm滤器过滤，4 ℃冰箱保存备用。
2.2 细胞划痕实验检测MCF-7细胞迁移能力
收集对数生长期MCF-7细胞，以2.5×105个/mL的密度接种于6孔中，2 mL/孔，置于37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养。培养至细胞长满培养板后，吸弃上清液，用10 μL吸头在6孔板上画“一”字，PBS轻轻冲洗2次。对照组加入基础培养基，药物干预组分别加入终浓度为4 mg/mL板蓝根、槐耳和槐耳板蓝根双向发酵提取物的MEM基础培养基（无FBS），各3个复孔，在100倍倒置显微镜下，分别于药物作用0、12、24 h时拍照，计算细胞愈合率（%）[（药物作用前痕迹宽度-药物作用后痕迹宽度）÷药物作用前痕迹宽度×100%]。实验重复3次。
2.3 Transwell细胞侵袭实验检测MCF-7细胞侵袭能力
Transwell小室及24孔板预冷，用无血清培养基按1∶5将Matrigel胶稀释，每个Transwell小室铺胶60 μL，37 ℃培养箱中过夜干燥，使用前无血清培养基水化30 min。收集对数生长期的MCF-7细胞，以2.5×105个/mL的密度接种于6孔板中，2 mL/孔，普通培养液培养过夜后，对照组加入基础培养基，药物干预组分别加入终浓度为4 mg/mL板蓝根、槐耳和槐耳板蓝根双向发酵提取物的MEM基础培养基（无FBS），设2个复孔，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。待药物作用MCF-7细胞48 h后，PBS洗2次，0.25%胰酶消化细胞，1000 r/min离心5 min，弃上清液，MEM培养基（含1%BSA）重悬细胞，细胞计数，调整MCF-7细胞密度至1×105个/mL，Transwell小室下室加750 μL含10%FBS的MEM培养基，接种细胞，取细胞悬液200 μL加入Transwell小室上室，常规培养24 h。弃去小室内培养液，PBS洗2次，甲醇固定20 min，PBS洗2次，风干，用0.1%结晶紫染色15～20 min，用湿棉签擦尽上室面的Matrigel基质胶和细胞，用清水洗3次，风干。将小室置于倒置显微镜下，PBS洗2次，选择中及上、下、左、右共5个象限计数，小室下室面细胞数即为穿透基质胶的细胞数。实验重复3次。
2.4 细胞黏附实验检测MCF-7细胞黏附能力
收集对数生长期MCF-7细胞，以2.5×105个/mL的密度接种于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。待24 h后，对照组加入基础培养基，药物干预组分别加入终浓度为4 mg/mL板蓝根、槐耳和槐耳板蓝根双向发酵提取物的MEM基础培养基（无FBS），设2个复孔，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。药物作用48 h后收集细胞，0.25%胰酶消化，1000 r/min离心5 min，弃上清液，10%FBS的MEM完全培养基重悬细胞并调整细胞密度为2×105个/mL。将细胞接种于24孔板，每孔加1 mL，设3个复孔，37 ℃、5%C02饱和湿度培养箱培养4 h，吸出培养液，PBS洗3次，洗去未黏附细胞。甲醇固定20 min（或95%乙醇固定10 min），用0.1%结晶紫染色15～20 min，清水洗3次，风干，拍照，计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照组细胞黏附数-药物干预组细胞黏附数）÷对照组细胞黏附数×100%]。实验重复3次。
2.5 RT-PCR检测MCF-7细胞细胞基质金属蛋白酶-9和波形蛋白基因表达
将5×105个细胞接种于25 cm2培养瓶中，普通培养液培养过夜后，根据分组换用不同培养液继续培养48 h后弃培养液。收集培养细胞，采用Trizol两步法提取MCF-7细胞内的总RNA，测定OD260/OD280，计算总RNA纯度和浓度。按试剂盒说明合成cDNA第1链，以此cDNA为模板进行PCR反应。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，58 ℃（β-actin）、60.5 ℃（MMP-9）、56.4 ℃（Vimentin）退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环。72 ℃延伸5 min，4 ℃冷却。取PCR产物进行琼脂糖电泳，Gene Snap凝胶成像系统照相并进行灰度值分析，以条带OD值代表其目的片段的表达量，以内参照β-actin的量校正，取二者OD值之比进行分析。每组实验重复3次。引物信息见表1。
3 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 槐耳板蓝根双向发酵提取物对MCF-7细胞增殖的影响
各药物处理MCF-7细胞48 h后，与对照组比较，细胞增殖能力被明显抑制（P<0.05）；与槐耳组和板蓝根组比较，槐耳板蓝根组抑制作用更强（P<0.05）。结果见图1。
4.2 槐耳板蓝根双向发酵提取物对MCF-7细胞迁移能力的影响
划痕24 h后，对照组痕迹几乎完全愈合，槐耳板蓝根组和槐耳组痕迹愈合率均明显下降，板蓝根组作用不明显，提示槐耳板蓝根双向发酵提取物具有明显抑制细胞迁移的作用（P<0.05）。结果见图2、图3。
4.3 槐耳板蓝根双向发酵提取物对MCF-7细胞侵袭能力的影响
药物作用48 h后，与对照组比较，各给药组细胞侵袭能力明显降低（P<0.05）；与板蓝根组和槐耳组比较，槐耳板蓝根组明显抑制细胞侵袭能力（P<0.05）。结果见图4、图5。
4.4 槐耳板蓝根双向发酵提取物对MCF-7细胞黏附能力的影响
药物作用48 h后，与对照组比较，各给药组细胞黏附能力明显降低（P<0.05）；与板蓝根组和槐耳组比较，槐耳板蓝根组明显抑制细胞黏附能力（P<0.05）。结果见图6、图7。
5 讨论
本研究选择槐耳和板蓝根进行双向发酵研究除考虑微生物可能改变板蓝根的物质基础外，还包含了2味中药的配伍思路，旨在研究现代炮制技术的同时探讨其可能存在的中药协同作用及两者配伍的科学性。板蓝根具有清热解毒、抗炎消肿、凉血利咽之功；槐耳能治风、破血、益力，具有增强免疫作用。二者配伍可能具有扶正祛邪的协同作用。本实验结果显示，槐耳板蓝根双向发酵提取物抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖作用明显优于2种药物单独干预，表明选择槐耳和板蓝根进行双向发酵研究是可行有效的。
肿瘤的转移和复发是癌症患者死亡的重要原因之一，研究表明，MMP-9和MMP-2与肿瘤侵袭、转移关系最密切，MMPs与乳腺癌及其他肿瘤转移密切相关[8-9]。细胞外基质（ECM）是肿瘤转移的天然屏障，肿瘤突破基底膜，进入ECM是癌症发生迁移和侵袭的第一步。MMP分子中，MMP-9是分子量最大的酶，以酶原的形式分泌到胞外，MMP-9被激活后能够降解和破坏肿瘤表面的ECM和基底膜，使癌细胞沿缺失的基底膜向周围组织侵袭[10]。上皮细胞向间质细胞的转变（EMT）是肿瘤转移浸润的一个关键步骤[11]。Vimentin是成纤维细胞中等纤维的主要构成成分之一，EMT发生时会使Vimentin表达水平显著升高[12]。细胞划痕实验、Transwell小室体外侵袭实验和细胞黏附实验结果显示，槐耳板蓝根双向发酵提取物可显著抑制细胞愈合及其穿过基质膜的数量和细胞贴壁能力，表明槐耳板蓝根双向发酵提取物抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭能力强于槐耳和板蓝根、二者配伍双向发酵具有更好的抗肿瘤细胞转移侵袭的药效作用。槐耳板蓝根双向发酵提取物可能通过抑制MMP-9和Vimentin基因表达抑制MCF-7细胞迁移和侵袭能力。
本实验结果初步显示，槐耳板蓝根双向发酵提取物可能通过抑制肿瘤细胞生长，调节某些迁移和侵袭相关因子的基因表达，减弱肿瘤细胞的侵袭力，从而发挥其抑制肿瘤的作用。提示中药双向发酵能够增强药物效果，比单独用药效果更好，符合中医配伍增效减毒的理论，值得今后深入研究。
参考文献：
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更新时间：2025/3/22 8:12:26