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标题 siRNA沉默细胞外信号调节激酶1/2基因协同甲亢宁胶囊对大鼠甲状腺细胞—5细胞增殖的影响
范文 林兰 王秋虹 易泳鑫


摘要：目的 通过甲亢宁胶囊（以下简称“甲亢宁”）协同siRNA干扰大鼠甲状腺细胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）中细胞外信号调节激酶（ERK）1/2基因，观察并探讨甲亢宁对FRTL-5细胞RNA干扰ERK1/2基因表达及对FRTL-5细胞增殖的影响。方法 将生长状态良好的FRTL-5细胞分为空白组、阴性对照组、甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组。利用siRNA沉默及甲亢宁协同干扰FRTL-5细胞的ERK1/2基因，RT-PCR检测ERK1/2 mRNA表达，Western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达，CCK8法检测细胞增殖。结果 RT-PCR检测结果显示，空白组和阴性对照组ERK1/2的mRNA表达无明显差异（P>0.05）；与空白组比较，siRNA组和甲亢宁组FRTL-5细胞ERK1/2 mRNA表达明显下降（P<0.01）；与空白组、阴性对照组比较，甲亢宁协同组ERK1/2 mRNA表达明显下降（P<0.01）；Western blott检测结果显示，与空白组、阴性对照组比较，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达相对量明显下降（P<0.01）。转染24、48 h后，CCK8法检测结果显示，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组细胞增殖受抑制，与空白组、阴性对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。结论 甲亢宁对ERK1/2磷酸化起阻断作用，ERK1/2基因被沉默后，对甲状腺细胞增殖有抑制作用，甲亢宁可协同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5细胞增殖。
关键词：甲状腺细胞；细胞外信号调节激酶1/2；甲亢宁胶囊；RNA干扰；增殖
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.012
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0043-04
Abstract： Objective To observe and explore the effects of Jiakangning Capsules on the expression of ERK1/2 gene and proliferation of FRTL-5 by studying the effects of Jiakangning Capsules collaborated with siRNA on interfering ERK1/2 gene in FRTL-5. Methods FRTL-5 cells in good conditions were divided into control group， negative control group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， siRNA interference group， and Jiakangning Capsules group. RT-PCR was performed to detect the expression of ERK1/2 gene in mRNA levels in FRTL-5； Western blotting was performed to detect the expressions of ERK1/2 and p-ERK1/2； CCK8 method was used to detect cell proliferation. Results RT-PCR results showed that the ERK1/2 mRNA expression of the control group and negative control group were of no significant difference （P>0.05）； compared with the control group， siRNA interference group and Jiakangning Capsules group could inhibit ERK1/2 gene mRNA expression in FRTL-5 （P<0.01）. Compared with the control group and negative control group， the ERK1/2 mRNA expression of Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group decreased obviously （P<0.01）. Compared with the control group and negative control group， the expression of p-ERK1/2， ERK1/2 of Jiakangning Capsules group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group decreased obviously （P<0.01）. At the time of 24 h and 48 h after transfection， according to the results of CCK8， compared with the control group and negative control group， the cell proliferation of Jiakangning Capsules group， Jiakangning Capsules collaborated with siRNA group， and siRNA interference group was inhibited （P<0.01）. Conclusion Jiakangning Capsules have blocking effect on the phosphorylation of ERK1/2. After ERK1/2 gene was silenced， the thyroid cell proliferation was inhibited. Jiakangning Capsules can collaborate with ERK1/2-siRNA to inhibit FRTL-5 cell proliferation.
Key words： thyroid cell； ERK1/2； Jiakangning Capsules； RNA interference； proliferation
Graves病（Graves disease，GD）是当前常见的甲状腺疾病之一，临床典型表现为甲状腺肿大、Graves眼病和高代谢症候群等。GD是甲状腺功能亢进症的最常见病因[1]。但临床中应用抗甲状腺药物治疗普遍存在复发率高、治疗周期长的缺点[2-3]。目前，临床上对GD发病过程中“甲状腺细胞异常过度增殖”这一关键环节，尚缺乏针对性的治疗药物[4]。本研究以细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）1/2基因为靶点，针对ERK1/2基因的siRNA特异性片段，采用Lipofectamine RNAiMAX Reagent转染试剂将其有效地转染入Fisher大鼠甲状腺细胞-5（fisher rat thyroid cell line-5，FRTL-5）细胞内，诱导ERK1/2基因沉默，从而研究RNAi效应对FRTL-5细胞ERK1/2基因表达的抑制作用及其对细胞增殖的抑制作用，探讨GD的治疗新策略。
1 实验材料
1.1 细胞
FRTL-5细胞（CRL1468）来源于ATCC细胞库。
1.2 药物及制备
甲亢宁胶囊（以下简称“甲亢宁”），中国中医科学院广安门医院，京药制字Z20063194，批号20151203。将1粒甲亢宁（0.45 g）溶于14.265 mL纯水中，配制成100 mg/mL甲亢宁母液，用0.22 μm滤器过滤至离心管，4 ℃保存。依据前期研究，用F12完全培养液将甲亢宁母液稀释成3 mg/mL[5]。
1.3 主要试剂与仪器
ERK1/2 siRNA由上海吉玛公司合成，序列参照文献[6]。ERK1/2siRNA序列：5'-GCCGCCGCCGCC GCCAT-3'，与MAPKmRNA翻译起始部位的17个碱基序列互补；随机核苷酸序列：5'-CGCGCGCTCGCG CACCC-3' Lipofectamine RNAiMAX Reagent，Invitrogen公司；Trizol reagent RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒及BCA蛋白质定量试剂盒，康为世纪生物公司；CCK8细胞增殖检测试剂，日本同仁公司；p-ERK1/2、ERK1/2抗体，美国CST公司；F12完全培养基（GIBCO），0.25%胰酶细胞消化液（杭州吉诺），胎牛血清、缓冲液（Hyclone）。细胞培养箱（日本SANYO公司），LP400型全自动酶标仪（法国巴斯德公司），96孔板（CORNING公司），微量加样器（Eppendorff公司）。
2 实验方法
2.1 分组与转染
将细胞接种于6孔板，每孔接种细胞5×104个。实验分为空白组、甲亢宁组、甲亢宁协同组（甲亢宁+ERK1/2-siRNA）、阴性对照组（NC组）、siRNA组，其中甲亢宁组、甲亢宁协同组、siRNA组为干预组。空白组、NC组、siRNA组加F12完全培养基3 mL，其余组加甲亢宁培养液3 mL。参照Lipofectamine RNAiMAX Reagent说明书分别对甲亢宁协同组、NC组、siRNA组进行转染。
2.2 引物的设计与合成
ERK1/2 mRNA序列从genebank查询，应用Oligo6.0软件设计引物，在BLAST上进行同源性分析。引物序列如下：ERK1-F，5'-CATCCGAGACATCCTC AGAGC-3'；ERK1-R，5'-GGTCGCAGGTGGTGTTGA TA-3'；ERK2-F，5'-AGGTTGTTCCCAAACGCTGA-3'；ERK2-R，5'-AGGTAAGTCGTCCAGCTCCA-3'；内参β-actin-F，5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'；内参β-actin-R，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'。
2.3 RT-PCR反应
首先配制反转录反应体系，将上述20 μL反应溶液65 ℃保温5 min，37 ℃ 保温40 min，70 ℃保温10 min。然后配制PCR反应体系。反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，58 ℃、60 s读板，共45个循环。以2-ΔΔct表示相对样品初始模板量。
2.4 Western blot检测大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达
提取细胞总蛋白，利用BCA法测定蛋白浓度，经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，室温封闭2 h。分别加入p-ERK1/2、ERK1/2一抗，4 ℃温育过夜，再加二抗37 ℃温育1 h后，胶片曝光，定影，凝胶成像系统分析。
2.5 CCK8法检测大鼠甲状腺细胞-5细胞增殖
调整FRTL-5细胞浓度为2×105个/mL，接种于96孔板中，每孔100 μL（每孔接种细胞约2×104个），转染方法同前。转染2 h后，吸去转染培养基，PBS洗2遍，加入F12完全培养基，置于细胞培养箱培养。收集转染24、48 h的细胞，每个时点设6个复孔，每孔加CCK8检测试剂10 μL，于酶标仪450 nm处测定吸光度（OD）值，按CCK8试剂盒说明书进行操作。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，采用方差分析，两两比较采用LSD法，方差不齐者采用近似F检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调节激酶1/2基因表达的影响
RT-PCR检测结果显示，空白组和NC组ERK1/2 mRNA表达无明显差异；与空白组比较，siRNA组和甲亢宁组能够抑制FRTL-5细胞ERK1、ERK2 mRNA表达明显下降（P<0.01）；与空白组、NC组比较，甲亢宁协同组ERK1/2 mRNA表达明显下降（P<0.01）。结果见表1。
4.2 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达的影响
Western blot检测结果显示，与空白组、NC组比较，甲亢宁组、siRNA组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平明显下降（P<0.01）；与空白组、NC组比较，甲亢宁协同组p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表达水平明显下降（P<0.01）。结果见表2、图1。
4.3 甲亢宁对大鼠甲状腺细胞-5细胞增殖的影响
CCK8检测结果显示，与空白组、NC组比较，甲亢宁组、siRNA组、甲亢宁协同组OD值下降，存活细胞较少，FRTL-5细胞增殖较慢，差异有统计学意义（P<0.01），表明通过下调ERK1/2 mRNA表达，可抑制FRTL-5细胞增殖。在24、48 h检测点时，与siRNA组比较，甲亢宁组OD值较大，差异无统计学意义（P>0.05）；在48 h检测点时，与空白组比较，NC组OD值较小，差异有统计学意义（P<0.05），这可能是阴性序列对细胞有一定的毒性作用所致。结果见表3。
5 讨论
FRTL-5是体外研究甲状腺生理病理机制的常用模型。FRTL-5细胞的增殖是一个多因素共同作用的复杂过程。大量体内外实验均已证实ERK1/2是促进细胞增殖的重要细胞信号传导途径[7-8]，ERK1/2自身在细胞增殖中起着重要作用，ERK通路的抑制对于改善甲状腺细胞过度增殖至关重要。我院于1978年开始，通过对大量甲亢患者系统的辨证研究发现甲亢病程中往往出现阴虚阳亢之象，阴虚阳亢证型为甲亢的基本证型，而后制备了具有滋阴潜阳化痰散结功效的甲亢宁。方中牡蛎滋阴潜阳、软坚散结为君；玄参滋阴清热生津，佐牡蛎散结为臣；甲状腺肿为痰凝所致，当化痰、软坚散结，以连翘、山慈菇加强散结之力。诸药合用，共奏滋阴潜阳、化痰散结之功。30余年的临床实践表明，该药在甲状腺功能亢进治疗方面具有良好的疗效[9]。课题组既往研究表明，ERK1/2是甲亢宁的关键作用靶点，调控ERK1/2蛋白表达可能是甲亢宁调控FRTL-5细胞增殖的关键环节[5]。寻找一种可高效抑制ERK1/2通路并有效抑制其增殖的方法将大大改善GD患者的预后。本实验将文献已报道的针对ERK1 mRNA、ERK2 mRNA的共同的siRNA 片段转染入FRTL-5细胞，利用 RNAi 技术在基因转录水平阻断ERK信号传导通路。上述结果表明，甲亢宁对ERK1/2的磷酸化起阻断作用，ERK1/2基因被沉默后，对甲状腺细胞的增殖有抑制作用，甲亢宁可以协同ERK1/2-siRNA抑制FRTL-5细胞增殖。
参考文献：
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[6] GLENNON P E， KADDOURS S， SALE E M， et al. Depletion of mitogen-activated protein kinase using an antisense oligodeoxynucleo-tide approach downregulates the phenylephrine- induced hypertrophic response in rat cardiac myocytes[J]. Circ Res，1996，78（6）：954-961.
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[8] WASEEM T， DUXBURY M， ASHLEY S W， et al. Ghrelin promotes intestinal epithelial cell proliferation through PI3K/Akt pathway and EGFR transactivation both converging to ERK1/2 phosphorylation[J]. Peptides，2014，52：113-121.
[9] 林兰，李鸣镝，刘喜明.中药甲亢宁治疗阴虚阳亢型甲状腺功能亢进症的临床研究[J].中国中西医结合杂志，1999，19（3）：144-147.
（收稿日期：2015-12-29）
（修回日期：2016-01-27；编辑：华强）
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更新时间：2025/2/11 6:44:06