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标题	育肾助孕方对雷公藤多苷致卵巢储备下降大鼠卵巢形态和性激素的影响
范文	金毓莉 张婷婷 许华云 袁雪菲 蔡小荪 摘要：目的 观察育肾助孕方对雷公藤多苷致卵巢储备功能下降大鼠卵巢组织形态和性激素的影响，探讨其作用机制。方法 采用雷公藤多苷药液灌胃制作卵巢储备功能下降大鼠模型。48只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组及育肾助孕方低、中、高剂量组，育肾助孕方各剂组分别给予低、中、高浓度育肾助孕方药液灌胃，阳性药组给予戊酸雌二醇药液灌胃，模型组和空白组给予等量生理盐水灌胃，2次/d，连续14 d。观察大鼠一般情况，取卵巢称重并计算脏器指数，HE染色观察卵巢组织形态，放射免疫法检测血清雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）水平，酶联免疫吸附法检测抑制素B（INHB）、抗苗勒管激素（AMH）水平。结果 与空白组比较，模型组卵巢组织萎缩，各级卵泡数目减少，卵巢指数和E2、INHB、AMH水平降低，FSH、LH水平升高（P<0.01）；与模型组比较，育肾助孕方高剂量组卵巢组织形态明显改善，各级卵泡和黄体增加，闭锁卵泡减少；卵巢指数和E2、INHB、AMH水平升高，FSH、LH水平降低（P<0.01），且INHB与AMH具有显著相关性（P<0.01）。结论 育肾助孕方可调节性激素水平，促进卵泡生长和分泌，抑制卵泡闭锁，从而改善卵巢储备功能。 关键词：育肾助孕方；卵巢储备功能；抑制素B；抗苗勒管激素；大鼠 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.015 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）06-0056-04 Abstract： Objective To observe the effects of Yushen Zhuyun Prescription on ovarian morphology and sex hormone of rats with decreased ovarian reservation （DOR） induced by tripterygium glycosides； To explore its mechanism of action. Methods Tripterygium glycosides solution was used to establish DOR model rats by gastric gavage. 48 female SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive medicine group and Yushen Zhuyun Prescription low-， medium- and high-dose groups. Yushen Zhuyun Prescription groups were given the low， medium， high dosages Yushen Zhuyun Prescription liquid； positive medicine group were given estradiol valerate liquid； model group and blank control group were given normal saline with the same amount， by gavage 2 times per day for 14 consecutive days. The general condition of the rats was observed； ovarian was weighed and the viscera index was calculated； ovarian morphology was observed by HE staining； the levels of serum estradiol （E2）， follicle stimulating hormone （FSH） and testosterone （T） were detected by radioimmunoassay； the levels of inhibin B （INHB） and anti Mullerian hormone （AMH） were detected by ELISA. Results Compared with the blank group， ovarian tissue atrophied； the number of follicles was reduced； ovarian index and the level of E2， INHB and AMH decreased； the levels of FSH and LH increased in the model group （P<0.01）. Compared with the model group， ovarian tissue morphology improved significantly； the number of follicle and corpus luteum increased； follicular atresia was reduced； ovarian index and the levels of E2， INHB， and AMH increased； the levels of FSH and LH decreased in Yushen Zhuyun Prescription high-dose group （P<0.01）. INHB and AMH had significant correlation （P<0.01）. Conclusion Yushen Zhuyun Prescription can regulate hormone levels， promote the growth and secretion of follicle， and inhibit follicular atresia， thereby improve ovarian reserve function. Key words： Yushen Zhuyun Prescription； ovarian reservation； inhibin B； anti Mullerian hormone； rats 卵巢储备功能（ovarian reservation，OR）是指卵巢皮质区卵泡生长、发育、形成可受精卵泡的能力，反映女性的生育潜能和生殖内分泌功能。卵巢储备功能下降（decreasing ovarian reservation，DOR）是指卵巢内存留的可募集卵泡数量减少，卵巢产生卵子能力减弱，卵泡质量下降，导致女性生育能力下降[1]，表现为月经稀发、闭经、不孕，甚至卵巢早衰等。其临床发病率呈上升趋势，也是目前引起不孕的主要原因之一。中医药在治疗不孕不育症、调整女性生殖内分泌功能失调性疾病方面有独到之处，疗效得到肯定。育肾助孕方为蔡氏妇科第7代嫡系传人蔡小荪教授的经验方，临床疗效显著[2]。本实验观察该方对DOR大鼠卵巢组织形态的影响和相关性激素水平的调节作用，探讨其作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物 48只清洁级健康雌性SD大鼠，12周龄，体质量250～280 g，上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号SCXK（沪）2012-0002。饲养于上海市第一人民医院清洁级实验动物中心，自由饮水和摄食。 1.2 药物 育肾助孕方（熟地黄10 g，山萸肉10 g，醋龟甲10 g，茯苓12 g，鹿角霜10 g，淫羊藿10 g，巴戟天10 g，肉苁蓉10 g），上述饮片均为中药免煎颗粒剂，广州一方中药厂，用纯净水配制成低、中、高3个浓度混悬药液，4 ℃冰箱保存备用。雷公藤多苷片，江苏美通制药有限公司，10 mg/片，批号131029；戊酸雌二醇片，Delpharm Lille S.A.S，批号089A2。 1.3 主要试剂与仪器 雌二醇（E2）、促卵泡刺激素（FSH）、睾酮（T）放射免疫分析药盒，北京北方生物科技研究所；抑制素（INH）B、抗苗勒氏管激素（AMH）酶联免疫试剂盒，武汉基因美生物科技有限公司。酶标仪（芬兰Labsystems Multiskan MS公司）。 1.4 造模、分组及给药 参照文献[3]方法，采用雷公藤多苷药液灌胃制作DOR大鼠模型。配制50 mg/mL雷公藤多苷药液及0.05 mg/mL浓度戊酸雌二醇药液。48只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组和育肾助孕低、中、高剂量组（中药低、中、高剂量组），每组8只。给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”[4]计算，中药低、中、高剂量组分别按临床等效剂量的0.5倍（0.69 g/kg）、1倍（1.38 g/kg）和2倍（2.76 g/kg）给药。每日9：00时，造模组灌服雷公藤多苷药液，15：00时中药低、中、高剂量组分别予不同浓度育肾助孕方药液灌胃，阳性药组予戊酸雌二醇药液灌胃，模型组和空白组予等量生理盐水灌胃。给药体积均为12 mL/kg，连续14 d。 1.5 指标检测 1.5.1 一般状况观察 观测大鼠体质量、饮食、活动、动情周期，计算卵巢指数。卵巢指数（%）=卵巢质量÷体质量×100%。 1.5.2 卵巢组织形态学观察 采血后断头处死大鼠，立即开腹取出卵巢，称重，福尔马林固定，24 h内梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，进行组织学检查。 1.5.3 雌二醇、促卵泡刺激素、睾酮检测 腹腔注射10%水合氯醛（0.6 mL/只）麻醉，腹主动脉取血后迅速置于促凝管中，室温下静置1 h，3000 r/min离心10 min，取血清待用。放射免疫法检测E2、FSH、T，严格按试剂盒说明进行操作。 1.5.4 抑制素B、抗苗勒管激素检测 取上述血清，ELISA检测INHB、AMH，严格按试剂盒说明进行操作。 1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，方差齐性数据再用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 一般状况结果 空白组大鼠饮食与活动基本无变化，给药结束时体质量正常增加，动情周期平均每次4～5 d；模型组大鼠饮食量减少，喜蜷缩，对刺激反应淡漠，给药结束时体质量增加相对减少，毛色黯淡、光泽减少，大多数无动情周期。阳性药组及中药高剂量组体质量基本正常，饮食、活动无明显变化，动情周期为5～6 d；中药低、中剂量组饮食略有减少，自发性活动略有减少，给药结束时体质量增加略有减少，动情周期分别为7～9 d、6～7 d。与空白组比较，模型组卵巢指数下降（P<0.01）；与模型组比较，各给药组卵巢指数均升高，除中药低剂量组外差异均有统计学意义（P<0.05，P<0.01））。结果见表1。 2.2 卵巢组织病理观察结果 空白组卵巢皮质与髓质结构清晰，可见各级卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡），卵泡形态、数量正常，颗粒细胞层次多，卵泡液含量多，黄体数目正常，有的可见多个黄体，发育好、体积大、色泽鲜艳，间质未见炎细胞浸润和纤维化，血管丰富；模型组部分卵巢见萎缩，各期卵泡数均减少，闭锁卵泡明显增多，颗粒细胞层数减少、排列紊乱，部分黄体数目减少，且黄体周边和间质区见有不同程度的炎细胞浸润，未见明显纤维化；阳性药组组织形态学接近空白组，但闭锁卵泡明显增多；中药低剂量组见各级卵泡，但数目比空白组少，黄体数目也减少，间质见少量炎细胞；中药中剂量组组织形态接近空白组，有少量闭锁卵泡；中药高剂量组组织形态接近空白组，各级卵泡数目类似，颗粒细胞层次丰富，黄体数目较多，间质未见炎细胞。结果见图1。 2.3 育肾助孕方对模型大鼠血清雌二醇、促卵泡刺激素和睾酮水平的影响
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