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标题 香鳞毛蕨提取物对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损的影响
范文 朱冲冲 彭冰 王燕 曾祖平 韩旭阳 王宏 王天园 何薇



摘要：目的 观察香鳞毛蕨提取物对咪喹莫特诱导银屑病样小鼠皮损的干预作用。方法 采用背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏制作银屑病样小鼠模型。72只6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、香鳞毛蕨提取物组和阳性药组，每组8只。模型组和空白组给予蒸馏水灌胃，各给药组给予相应药物灌胃，每日0.3 mL，连续6 d。采用银屑病皮损面积和严重程度指數（PASI）评分标准观察银屑病样小鼠皮损变化。光镜下观察皮损组织形态学变化，测量表皮层厚度；检测小鼠脾指数。结果 与空白组比较，模型组小鼠皮肤出现鳞屑、红斑，皮损增厚；皮损组织表现为表皮棘细胞层增厚，角化不全；脾脏肥大；与模型组比较，香鳞毛蕨提取物组小鼠银屑病样皮损症状缓解，PASI积分降低，角化不全减轻，脾指数明显降低。结论 香鳞毛蕨提取物可显著改善咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损。
关键词：香鳞毛蕨提取物；银屑病；皮肤损伤；小鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.011
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）05-0044-04
Effects of Dryopteris Fragrans Extracts on Psoriasis-like Skin Lesions Induced by Imiquimod in Mice ZHU Chong-chong， PENG Bing， WANG Yan， ZENG Zu-ping， HAN Xu-yang， WANG Hong， WANG Tian-yuan， HE Wei （Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Capital Medical University， Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine， Beijing Key Laboratory of Clinic and Basic Research with Traditional Chinese Medicine on Psoriasis， Beijing 100010， China）
Abstract： Objective To observe the intervention effects of Dryopteris fragrans extracts on psoriasis-like skin lesions induced by imiquimod in mice. Methods A psoriasis-like mouse model was made by applying 5% imiquimod cream daily on the back. Totally 72 6–8 week old male BALB/c mice were randomly divided into control group， model group， Dryopteris fragrans extracts groups and positive medicine group， 8 mice in each group. The model group and the control group were given distilled water for gavage. The mice in each administration group were given relevant medicine for gavage， 0.3 mL daily， for 6 days. The skin lesions were evaluated according to the psoriasis area and severity index （PASI）. The histology and epidermal thickness were observed under light microscope. The spleen index was detected to reflect the changes of spleen in mice. Results Compared with control group， the erythema scales and skin lesions were thickened in the model group； lesions of the performance of the epidermis acanthosis was thickening， parakeratosis； spleen hypertrophy. Compared with model group， the cutaneous symptoms in Dryopteris fragrans extracts groups were alleviated； PASI scores decreased； epidermal parakeratosis was relieved； the spleen index was lower than that of model group. Conclusion Dryopteris fragrans extracts can significantly improve the psoriasis-like skin lesions induced by imiquimod in mice.
Key words： Dryopteris fragrans extract； psoriasis； skin lesions； mice
银屑病俗称“牛皮癣”，中医学称之为“白疕”，是常见的免疫介导的慢性炎症性皮肤疾病。由于其病程长，皮损广泛，常给患者身心健康带来严重影响。
香鳞毛蕨Dryopteris fragrans（L.）Schott是鳞毛蕨科Dryopteridaceae鳞毛蕨属Dryopteris Adans.植物，多生长于高寒地区的滑石坡、森林中的碎石坡和火山周围的岩浆缝隙中，主要分布于我国东北、华北及俄罗斯、日本、朝鲜等。国内有学者采用鼠尾鳞片表皮模型研究香鳞毛蕨提取物对银屑病的作用效果，发现其提取物可通過促进表皮颗粒层形成而对银屑病有一定的治疗效果[1-2]，也有研究发现香鳞毛蕨乙醇提取物对糠秕马拉色菌引起的银屑病有较好的治疗作用[3]。本实验采用咪喹莫特诱导制作银屑病样小鼠模型，观察香鳞毛蕨对其皮损的干预作用。
1 实验材料
1.1 动物
雄性SPF级BALB/c小鼠72只，6～8周龄，体质量（20±2）g，中国食品药品检定研究院，动物许可证号SCXK（京）20140013。饲养于SPF级动物室，室温22～26 ℃，湿度30%～50%，自由摄食饮水。
1.2 药物
香鳞毛蕨采自黑龙江省五大连池地区，经北京中医药大学中药学院高增平教授鉴定为Dryopteris fragrans（L.）Schott，凭证标本（DF0110801）保存于北京市中医研究所；咪喹莫特乳膏，四川明欣药业有限责任公司，批号20140828；甲氨蝶呤片（MTX），上海信宜药厂有限责任公司，批号20150722。
1.3 主要试剂与仪器
0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na），化学纯，国药集团化学试剂有限公司。正置荧光显微镜（ZEISS，德国）；组织脱水机，轮转式切片机，石蜡包埋机（LEICA，德国）。
2 实验方法
2.1 香鳞毛蕨提取物制备
醇提物：香鳞毛蕨粗粉50 g，加95%乙醇600 mL浸0.6 h，超声处理0.6 h，抽滤，减压浓缩至无醇味，加0.5%CMC-Na制成混悬液50 mL，稀释得含原药材0.8 g/mL（高）、0.4 g/mL（中）、0.2 g/mL（低）剂量组；水提物：香鳞毛蕨粗粉50 g，加入蒸馏水600 mL浸0.6 h，超声0.6 h，抽滤，减压浓缩，加0.5%CMC-Na制成混悬液50 mL，稀释得含原药材0.8 g/mL（高）、0.4 g/mL（中）、0.2 g/mL（低）剂量组。
2.2 造模及分组
参考文献[4]方法，背部每日涂抹5%咪喹莫特乳膏约42 mg，制作银屑病样小鼠模型。实验前将80只BALB/c雄性小鼠0.1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，背部2 cm×3 cm去毛后单笼饲养。次日选取背部较光滑、无伤口小鼠72只，随机分为空白组、模型组、阳性药组、香鳞毛蕨醇提物和水提物高、中、低剂量组，每组8只。模型组和空白组小鼠每日给予蒸馏水灌胃，阳性药组小鼠每日给予1 mg/kg MTX溶液灌胃，各给药组小鼠每日给予相应药物灌胃。给药体积均为0.3 mL，连续6 d。第7日小鼠脱颈处死，剪取背部皮肤并取脾称重。
2.3 检测指标
2.3.1 皮损积分 采用数码照相方法每日记录，并依据银屑病皮损面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index，PASI）评分标准，对小鼠皮损处红斑、鳞屑及浸润增厚程度计分，三者积分相加为总积分。PASI评分标准：0分，无；1分，轻度；2分，中度；3分，重度；4分，极重度。对各组小鼠积分取平均值。
2.3.2 皮损病理改变 小鼠脱颈处死后，各组剪取相对应皮损处组织。10%福尔马林固定，经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，镜下观察并照相。测量表皮厚度。
2.3.3 脾指数 小鼠称重，处死后取脾脏称重，计算脾指数（脾质量÷体质量）。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 香鳞毛蕨提取物对模型小鼠皮损部位鳞屑、浸润增厚、红斑及皮损积分的影响
与空白组比较，咪喹莫特涂抹1 d后模型组皮肤即出现鳞屑，第7日最严重；2～3 d出现红斑；皮肤持续增厚，出现类似银屑病样皮损。随着药物作用的积蓄，模型组皮损越加严重，红斑由淡粉色斑点变为大面积深红色斑块，鳞屑由散在零星小点变为片状；皮肤浸润、增厚明显。阳性药组、香鳞毛蕨醇提物和水提物中、高剂量组皮损较模型组症状明显减轻，皮肤较光滑，鳞屑较少，红斑变浅，浸润增厚减轻；香鳞毛蕨提取物低剂量组皮肤较粗糙，鳞屑较多呈片状，浸润增厚较重，与模型组比较有所减轻但症状不明显。结果见图1、图2。
4.2 香鳞毛蕨提取物对模型小鼠皮损病理的影响
HE染色结果显示，治疗7 d后，空白组皮肤表皮层较薄，模型组角化不全明显，表皮棘细胞层增厚，类似银屑病样的皮损形成。香鳞毛蕨醇提物、水提物组皮损中表皮层较平整，角化不全细胞明显减少，表皮层厚度明显低于模型组，作用结果与阳性药组相似，见图3。通过测量表皮层垂直厚度发现，模型组表皮层明显增厚，约为空白组小鼠表皮厚度4～5倍，香鳞毛蕨醇提物、水提物组表皮层增厚较低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），其中醇提物高剂量组抑制表皮增厚效果最为明显，见图4。
4.3 香鳞毛蕨提取物对模型小鼠脾脏的影响
模型组小鼠脾指数明显高于空白组；与模型组比较，香鳞毛蕨水提物和醇提物中、高剂量组小鼠脾指数明显低于模型组（P<0.05），其中香鳞毛蕨醇提物高剂量组明显低于其他各给药组（P<0.05，P<0.01）。结果见图5。
5 讨论
银屑病是一种常见的多基因遗传、多环境因素诱导的慢性炎症增殖性皮肤病[5]，现代医学定义其为免疫介导的器官特异性自身免疫性疾病，基本病理特点是表皮细胞增殖过快和角化不全[6]，临床表现为红色丘疹或境界清楚的斑块，表面覆盖有银白色鳞屑，可局部发作，也可以泛发全身。
香鳞毛蕨是鳞毛蕨属药用植物绵马贯众同属植物，具有抗肿瘤[7]、抗菌[8]、抗氧化[9]、抗炎[10]作用，并对各种皮肤病如银屑病、皮疹、痤疮等有较好的疗效[11]，东北地区民间广泛用于治疗皮肤疾病，被誉为“皮肤病克星”。
咪喹莫特是咪唑喹啉胺类免疫应答调节剂，该药可以诱发人类和鼠类银屑病。咪喹莫特是Toll样受体（TLR）激动剂，TLR的激活主要通过3个途径发挥作用：①白细胞介素（IL）-23/IL-17炎性反应轴；②IL-27激活Th1细胞应答途径；③氧化应激途径。TLR的激活有助于宿主免疫反应的发生，进而因其一系列的炎症反应和免疫损伤，也可促进抗微生物肽的释放，活化对氧化还原敏感的细胞信号转导途径，促进炎性细胞因子和趋化因子的表达。
本实验结果显示，香鳞毛蕨醇提物和水提物中、高剂量组小鼠皮肤症状明显缓解，皮损症状明显减轻，皮肤较光滑，鳞屑较少，红斑色浅，浸润、增厚较轻，PASI积分显著降低，组织形态趋于正常，表皮角质形成细胞增殖减缓，角化不全细胞减少；香鳞毛蕨醇提物和水提物低剂量组改善不明显。与其他给药组比较，香鳞毛蕨醇提物高劑量组作用最明显。
脾脏是机体重要的免疫器官，脾指数的意义在于提示免疫能力的强弱状态。实验结果显示，香鳞毛蕨提取物各剂量组小鼠脾指数较模型组降低，表明香鳞毛蕨提取物通过降低机体免疫而达到抑制银屑病的作用，香鳞毛蕨提取物高剂量组脾指数明显降低。
综上所述，香鳞毛蕨乙醇提取物和水提取物在一定程度上可抑制机体免疫，减轻咪喹莫特致小鼠银屑病样皮损症状。在后续的研究中，我们将对香鳞毛蕨治疗银屑病的作用机制及其有效成分进一步深入探讨。
参考文献：
[1] 沈志滨，金哲雄，张德连，等.香鳞毛蕨治疗银屑病的药理作用研究[J].中草药，2002，33（5）：448-449.
[2] 罗荣，金哲雄，张延萍.香鳞毛蕨擦剂的药效学研究[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2003，19（4）：388-390.
[3] 王洁，唐春萍，江涛，等.香鳞毛蕨有效部位对糠秕马拉色菌的体外抗真菌作用研究[J].中成药，2015，37（3）：642-645.
[4] FITS L V， MOURITS S， VOERMAN J S， et al. Imiquimod induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis[J]. J Immunol，2009，182（9）：5836-5845.
[5] 郑敏.银屑病发病机制研究中若干问题的思考[J].中华皮肤科杂志， 2006，39（3）：121-123.
[6] 底婷婷，赵京霞，王燕，等.凉血活血胶囊对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样皮损的干预作用[J].中国病理生理杂志，2012，28（4）：718-722.
[7] SONG R， LI G， LI S. Aspidin PB， a novel natural anti-fibrotic compound， inhibited fibrogenesis in TGF-β1-stimulated keloid fibroblasts via PI-3K/Akt and Smad signaling pathways[J]. Chem Biol Interact，2015，238：66-73.
[8] GAO C， GUO N， LI N， et al. Investigation of antibacterial activity of aspidin BB against Propionibacterium acnes[J]. Arch Dermatol Res，2016，308（2）：79-86.
[9] LI X J， WANG W， LUO M， et al. Solvent-free microwave extraction of essential oil from Dryopteris fragrans and evaluation of antioxidant activity[J]. Food Chem，2012，133（2）：437-444.
[10] PENG B， BAI R F， HAN X Y， et al. Two new glycosides from Dryopteris fragrans with anti-inflammatory activities[J]. J Asian Nat Prod Res，2016，18（1）：59-64.
[11] 范华倩，沈志滨，唐春萍.香鳞毛蕨化学成分及其治疗皮肤病药理作用的研究进展[J].时珍国医国药，2013，24（1）：199-201.
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更新时间：2024/12/23 3:08:21