| 标题 | 柴胡分子生药学研究进展 |
| 范文 | 韩晓伟 严玉平 吴兰芳 杨加虎 郑玉光 摘要：分子生药学是一门新兴的以生药为研究对象的交叉学科，其发展为传统的生药学研究提供了新的理论方法和技术，使对生药的研究达到了基因水平。柴胡作为传统中药，在传统研究方法基础上，也开展了分子生药学研究，并取得了一定成果。本文综述了近年来采用分子生药学手段的柴胡相关研究，并对该领域进行了展望，以期为进一步推动柴胡资源及其他中药资源的保护、开发和利用提供参考。 关键词：分子生药学；基因；柴胡；分子生物技术；中药资源 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.07.032 中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）07-0125-04 Abstract： Molecular pharmacognosy is an emerging interdisciplinary subject with crude drugs as research subjects. Its development provides a new theoretical method and technique for traditional pharmacognosy research， so that the study of crude drugs has reached the level of gene. As traditional Chinese materia medica， Bupleuri Radix has developed molecular pharmacognosy research on the basis of traditional research methods， and achieved certain results. This article summarized the research achievements of Bupleuri Radix through molecular pharmacognosy method in recent years， and prospected this field， in order to further provide references for the protection， development and utilization of Bupleuri Radix resources and other TCM resources. Key words： molecular pharmacognosy； gene； Bupleuri Radix； molecular biological technology； TCM resources 分子生药学是生药学和分子生物学相互融合形成的一门新兴的交叉学科，由黄璐琦院士在1995年首次提出[1]。分子生药学的提出，使生药学研究有了新的理论方法和技術，使我国生药学研究又迈上了一个新的台阶。经过20多年的发展，分子生药学在中药分子标识鉴定、中药资源保护和利用、中药优质高产方面都取得了很好的成果，使生药学研究不再停留于药用植物组织器官的层面，而是扩展到基因的层面，为后基因组时代研究中草药奠定了基础[2]。 柴胡是我国常用的大宗中药材之一，历代本草典籍对其药性都有明确记载。柴胡性味苦寒，入肝胆经，具和解表里、疏肝、升阳之功效，主要用于感冒发热，寒热往来、胸胁胀痛、月经不调、子宫脱垂、脱肛等病证的治疗。2015年版《中华人民共和国药典》[3]中规定的正品柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡B. scorzonerifolium Willd.的干燥根，前者习称“北柴胡”，后者习称“南柴胡”。在分子生药学发展的20多年里，关于柴胡的分子生药学方面的研究也在持续进行。本文对近年柴胡分子生药学方面的研究进行了总结，以期为在分子水平对柴胡进行更深层次的研究提供参考。 1 柴胡生药鉴定的分子标记研究 生药鉴定是生药学的重要组成部分，生药鉴定的主要任务是研究生药的来源、品种鉴定、质量评价等。我国生药的品种繁多、来源复杂，在一定程度上制约了中药的安全应用。柴胡作为我国常用的大宗中药材，具有来源复杂、品种丰富等特点[4]，而利用传统的理化鉴别和性状鉴别的方法不能准确鉴别柴胡药材的来源和种属，因此，利用分子标记技术研究柴胡的种属鉴别逐渐成为研究热点。 分子标记技术以1974年Grozdicker首创RFLP（限制性片段长度多态性）为开端，到2003年Paul Hebert提出DNA条形码技术，短短30年的时间里各国的科学家提出了十几种分子标记技术，其中常用的有RFLP、RAPD（随机扩增多态性DNA）、SSR（简单重复序列）、AFLP（扩增片段长度多态性）、ISSR（简单重复序列区间）和DNA barcoding（DNA条形码）等。 1.1 RAPD技术 RAPD是第二代分子标记技术，该技术在植物中的应用比较广泛，但其不足之处是稳定性相对较差，不同的物种需要使用不同的反应条件，即使同一物种的同一引物在实验条件改变时产生的谱带也会发生改变。AFLP技术与RAPD技术相似，其特点也是可以简单快速的鉴定植物，但其稳定性也不佳。2002年，梁之桃等[5]对柴胡属的物种植物进行了RAPD分析和分类鉴别，这是对柴胡进行RAPD研究的开始。2003年，王秀全等[6]对柴胡种源的道地性进行了RAPD分析，发现利用RAPD可以准确的鉴定柴胡的道地性。随着对柴胡研究的深入，全国柴胡的主产区都开展了柴胡品种的RAPD鉴定[7-10]，同时，对RAPD的技术进行了一些优化[11]，使其更适合柴胡的分析。在资源鉴定的基础上，对柴胡的干根药材、愈伤组织、试管植株等进行了RAPD分析[12-14]。 1.2 SSR和ISSR技术 SSR又称为微卫星DNA或短串联重复，ISSR是在SSR的基础上发展起来的一种分子标记技术。SSR和ISSR可揭示更高的多态性，而且快速、简便，因此在中药材鉴定中得到了广泛应用。2008年，隋春等[15]首次以北柴胡为材料进行了ISSR分析，这为利用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助育种以及遗传多样性研究奠定了基础。2010年，战晴晴等[16]利用SSR和ISSR技术构建了北柴胡的遗传图谱，使对柴胡的研究进一步深入。2013年，杨旻等[17]利用综合评分法对柴胡的ISSR-PCR反应体系进行了优化。2015年，马艳芝等[18]对不同柴胡种质资源的ISSR和ITS进行了序列分析，认为将ISSR和ITS（转录间隔区）技术相结合可提高柴胡种质资源鉴定的准确性。随着SSR和ISSR技術的不断完善，利用该技术鉴定柴胡的研究不断深入。赵香妍等[19]对北京地区野生的柴胡种质资源进行了ISSR研究，确定了百花山山腰及山脚的柴胡适宜推广种植，为柴胡栽培品种的选育提供了新选择。吴素瑞等[20]对柴胡的栽培品种进行了SSR的分子标记鉴别。通过长期反复的实验摸索，采用SSR和ISSR技术成为鉴别柴胡种质资源的有效方法。 1.3 DNA条形码 DNA条形码的鉴定是分子鉴定的最新发展方向，它是通过比较物种中的一段标准的DNA片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定[21]。适于植物的条形码包括psbA-TrnH、rbcL、rpoC1、rpoB、matK、ITS、ITS2等。2004年，Neves S S等[22]首次基于柴胡属植物的ITS序列对其进行了聚类分析。2005年，武莹等[23]对5种习用柴胡进行了ITS的序列鉴别。2006年，谢晖等[24]对9种柴胡属植物的核糖体ITS序列进行了扩增和应用。近5年来，柴胡的鉴定主要以ITS和ITS2扩增为主要方法[25-29]，这为柴胡种质资源鉴定以及药材市场柴胡的真伪鉴别提供了快速简便的方法。 在ITS扩增的研究基础上，刘力等[30]进行了DNA芯片研究，涉及18种柴胡DNA芯片，发现基于18种柴胡的ITS序列的差别所设计的DNA芯片可以将其区分开，这为柴胡的鉴定提供了新的方法。 2 柴胡有效成分生物合成分子机理与调控研究 传统中药材的有效成分绝大多数为次生代谢产物，合成路径复杂，其反应过程往往需要十几个甚至几十个酶的催化，因此，找到形成特定产物的关键酶就成为对药材进行合成的分子机理与调控研究的关键步骤，从而进一步利用基因工程技术生产药用植物的有效成分。柴胡皂苷的结构均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，20世纪90年代，人们对萜类的生物合成途径进行了研究，根据Ruzika原则提出了萜类生物合成的中心途径。在此基础上，董乐萌等[31]开始对合成皂苷途径的关键酶的基因片段进行了克隆和序列分析，为进一步克隆全序列及了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。2010-2015年，北柴胡鲨烯合酶基因[32]、IPPI基因[33]、UGT基因[34]、北柴胡细胞色素P450基因[35]、北柴胡糖基转移酶基因BcUGT1[36]、BcUGT3和BcUGT6[37]、BcUGT8[38]、与P450相关基因cyp716y1[39]等与北柴胡皂苷合成相关基因相继被克隆和分析，同时还进行了一些遗传转化方面的初步研究[40]。此类研究为揭示柴胡皂苷合成途径的分子机理奠定了基础。 中药材是非模式植物，因此进行基因克隆一般按照与其相似的植物序列来设计通用引物，序列扩增后还要进行比对，从而确定是否为该药用植物的正确序列。这种研究基因的方法工作量很大，且无法反映基因表达的全貌。转录组研究较好克服了上述缺点，具有时间性和空间性，它反映的是特定条件下活跃表达的基因。通过转录组的分析，可高通量地获得基因表达的RNA水平相关信息，而且可揭示基因表达和生命现象之间的联系，从而揭示生命体的生理活动规律，确定其代谢特性[2]。2011年，Sui C等[41]利用新一代的高通量测序技术454 GS-FLX Titanium对北柴胡进行了转录组研究，揭示了柴胡皂苷合成的分子途径，为后续的皂苷关键酶基因克隆及功能分析奠定了基础。2015年，该课题组对“南柴胡”和“北柴胡”进行了转录组分析，揭示了二者之间皂苷合成途径的差异，为从分子水平揭示道地药材形成的原因提供了较好范本[42]。 3 胁迫条件下柴胡皂苷合成的分子机制研究 许多植物的药效成分都是该植物的次生代谢产物，植物次生代谢产物是植物对环境的一种适应，同时也是植物的主要防御机制之一，植物的防御反应可诱导多种萜类的次生代谢产物的产生和积累[43]。2016年，张宇等[44]研究了干旱胁迫下北柴胡中柴胡皂苷合成途径关键酶基因表达量的变化，发现适度的干旱胁迫能够提高柴胡皂苷合成途径关键酶基因表达量，同时发现基因表达量与皂苷含量呈正相关，从而为揭示胁迫下药用植物药效成分积累的分子机制奠定了基础。 随着柴胡转录组研究和功能基因的克隆与分析的深入，柴胡响应胁迫的分子机制的研究必将取得较大发展。 4 柴胡细胞、组织和转基因器官培养与活性成分生产 运用分子生物学的方法来研究中药材的最终目的是最大限度地获得中药材的药效成分，从而弥补中药材资源不足的情况。利用细胞培养以及转基因技术可以快速、安全地获得中药材的药效成分，是中药材研究和开发的新方向。柴胡的细胞培养研究尚处在初级水平。1995年，郝建平等[45]进行了柴胡细胞的固定化培养，但之后的十几年此类研究发展不大。2008年，吴晓玲等[46]进行了银柴胡细胞培养的尝试。2012年，徐爽等[47]研究了三岛柴胡悬浮细胞的培养并对培养条件进行了优化。2016年，程玉鹏等[48]对狭叶柴胡的愈伤和悬浮细胞成分进行了分析。上述研究为大规模进行柴胡的细胞培养进行了有益的探索。 5 展望 柴胡的分子生药学研究只是我国中药材研究的一部分，而利用分子生药学技术对柴胡的研究尚处于起步阶段，前景广阔。利用分子生药学可以辨别柴胡的真伪，阐述皂苷合成的分子机理，但由于柴胡完整的基因序列尚不明确，大部分柴胡基因相关研究只是一个“近似值”，这也是我国中药材研究的现状。 利用分子生药学的方法研究中药材实现了我国中药材研究的突破，使我国中药材研究迈入新的阶段，为中药材资源保护和利用开创了新的局面。 参考文献： [1] 黄璐琦.分子生药学：第二版[M].北京：北京大学医学出版社，2000. [2] 袁媛，黄璐琦.中药资源转录组分析操作指南[M].上海：上海科学技术出版社，2016：3-13. [3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：280. [4] 雷天莉，任宇豪，李敬，等.北柴胡地上茎不同分支对根中皂苷类成分量及根产量的影响[J].中草药，2014，45（13）：1920-1923. [5] 梁之桃，秦民坚，王峥涛，等.柴胡属5种植物RAPD分析和分类鉴别[J].中草药，2002，33（12）：1117-1119. [6] 王秀全，李玉新，李会成，等.北柴胡种源道地性的RAPD分析[J].中药材，2003，26（12）：855-856. [7] 杨旻.保康柴胡的植物学鉴定及PAPD分析[D].武汉：湖北中医药大学，2006. [8] 邵天玉，朴锦，吕龙石.用RAPD分子标记技术分析长白山区柴胡的亲缘关系[J].延边大学农学学报，2009，31（2）：89-92. [9] 高可青.晋产优质北柴胡植物學性状比较及RAPD分析[D].太原：山西大学，2012. [10] 赵艮银，南晓洁，郝媛媛，等.柴胡栽培种的RAPD和AFLP遗传关系研究[J].中草药，2010，41（1）：113-117. [11] 杨旻，胡继鹰，陈科利，等.综合评分法优化柴胡RAPD-PCR反应体系[J].中成药，2009，30（5）：722-726. [12] 南晓洁，郝媛媛，赵艮银，等.柴胡药材干根DNA提取及RAPD分析[J].中草药，2009，40（2）：447-451. [13] 付杨，陈凤清，孙冬雪，等.大叶柴胡愈伤组织继代培养及其RAPD分析[J].东北师大学报：自然科学版，2005，37（2）：90-92. [14] 赵瑒，高可青，郝建平，等.晋产北柴胡试管植株的RAPD分析[J].山西大学学报：自然科学版，2013，36（2）：267-270. [15] 隋春，魏建和，陈士林，等.柴胡ISSR_PCR反应体系的建立与优化[J].时珍国医国药，2008，19（8）：1837-1839. [16] 战晴晴，隋春，魏建和，等.利用ISSR和SSR分子标记构建北柴胡遗传图谱[J].药学学报，2010，45（4）：517?523. [17] 杨旻，胡继鹰.利用综合评分法优化柴胡ISSR-PCR反应体系[J].现代中药研究与实践，2013，27（3）：23-24. [18] 马艳芝，客绍英.不同柴胡种质资源的ISSR和ITS序列分析[J].西北农林科技大学学报，2015，43（1）：193-200. [19] 赵香妍，刘长利，薛文峰，等.北京地区野生柴胡种质资源的ISSR研究[J].中国现代中药，2015，17（10）：1008-1013. [20] 吴素瑞，高珂，赵立子，等.利用SSR分子标记鉴别柴胡栽培种质的方法学研究[J].世界科学技术-中医药现代化，2015，17（9）：1806-1812. [21] 陈士林.中药DNA条形码分子鉴定[M].北京：人民卫生出版社，2012. [22] NEVES S S， WATSON M F. Phylogenetic relationships in Bupleurum （apiaceae） based on nuclear ribosomal DNA its sequence data[J]. Annals of Botany，2004，93（4）：379. [23] 武莹，刘春.5种习用柴胡的ITS序列鉴别[J].中国中药杂志，2005， 30（10）：732-734. [24] 谢晖，晁志.9种柴胡属植物的核糖体ITS序列及其在药材鉴定中的应用[J].南方医科大学学报，2006，26（10）：460-463. [25] 周琳，迟莹，张丽华，等.柴胡与四种伪品的DNA指纹研究[J].北华大学学报：自然科学版，2013，14（1）：46-49. [26] 迟莹，周琳，张丽华，等.柴胡及其常见伪品的DNA指纹鉴定[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（15）：143-146. [27] 于俊林，赵莎，任明波，等.基于ITS2条形码鉴定柴胡与大叶柴胡[J].中国中药杂志，2014，39（6）：2160-2183. [28] 袁伯川，马永生，杨瑞，等.北柴胡与银州柴胡的ITS条形码鉴定研究[J].生物技术通讯，2016，27（1）：101-105. [29] 韩晓伟，严玉平，吴兰芳，等.柴胡及其伪品的DNA条形码鉴定研究[J].中草药，2016，47（9）：1583-1588. [30] 刘力，晁志，杨志业，等.基于ITS区多态性研制用于柴胡属植物来源生药鉴定的寡核苷酸DNA芯片[M].中国药学杂志，2010，45（1）：821-824. [31] 董乐萌，刘玉军，魏建和.柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析[J].世界科学技术-中医药现代化，2008，10（5）：56- 60. [32] 隋春，魏建和，战晴晴，等.北柴胡鲨烯合酶基因及其编码区cDNA克隆与序列分析[J].园艺学报，2010，37（2）：283-290. [33] 隋春，战晴晴，魏建和，等.北柴胡皂苷生物合成途径关键酶IPPI的全长cDNA克隆及其序列分析[J].中草药，41（7）：1178-1184. [34] 隋春，徐洁森，赵立子，等.北柴胡UGT基因的克隆及其过量表达和RNAi转基因载体的构建[J].中国中药杂志，2012，37（5）：558-563. [35] 徐洁森，魏建和，赵立子，等.北柴胡细胞色素P450酶基因的克隆及其植物过量表达载体的构建[J].生物技术通讯，2012，23（4）：537-541. [36] 陶韵文，徐洁森，魏建和，等.北柴胡糖基转移酶基因BcUGT1的表达分析及其原核表达与蛋白纯化[J].药学学报，2013，48（8）：1345?1352. [37] 陶韵文，徐洁森，孙晶，等.北柴胡糖基转移酶基因BcUGT3、BcUGT6的表达分析及其原核表达[J].中国中药杂志，2014，39（2）：185-191. [38] 徐洁森，魏建和，陶韵文，等.北柴胡糖基转移酶基因BcUGT8的克隆、序列分析及其原核表达载体构建[J].中草药，2013，44（17）：2453-2459. [39] MOSES T， POLLIER J， ALMAGRO L， et al. Combinatorial biosynthesis of sapogenins and saponins in saccharomyces cerevisiae using a C-16α hydroxylase from Bupleurum falcatum[J]. PNAS，2014， 111（4）：1634-1639. [40] 徐杰森.北柴胡皂苷合成相关P450、UGT基因的筛选、克隆及遗传转化初步研究[D].北京：北京协和医学院，中国中医科学院，2013. [41] SUI C， ZHANG J， WEI J H， et al. Transcriptome analysis of Bupleurum chinense focusing on genes involved in the biosynthesis of saikosaponins[J]. BMC Genomics，2011，12（1）：539. [42] SUI C， CHEN M， XU J S， et al. Comparison of root transcriptomes and expressions of genes involved in main medicinal secondary metabolites from Bupleurum chinense and Bupleurum scorzonerifolium， the two Chinese official Radix bupleuri source species[J]. Physiologia Plantarum，2015，153（2）：230-242. [43] 张争，杨云，魏建和，等.环境因子导致的植物防御反应与药用次生代谢物的合成和积累[J].植物生理学通讯，2009，45（9）：919-924. [44] 张宇，周自云，夏鹏国，等.干旱胁迫对柴胡中皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响[J].中国中药杂志，2016，41（4）：643-647. [45] 郝建平，周小梅，薛强，等.柴胡细胞固定化培养[J].山西大学学报：自然科学版，1995，18（2）：190-193. [46] 吴晓玲，邓光存.磷酸盐含量对银柴胡细胞培养生长与生理特性的影响[J].江苏农业科学，2008，36（6）：66-68. [47] 徐爽.三岛柴胡悬浮细胞系的获得及培养条件的优化[D].齐齐哈尔：齐齐哈尔大学，2012. [48] 程玉鹏，李天聪，高宁，等.狭叶柴胡愈伤组织和悬浮细胞成分的UPL/ Q-TOF-MS分析[J].山西農业大学学报：自然科学版，2016，36（3）：186- 190. （收稿日期：2016-08-08；编辑：向宇雁） |
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