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标题 三波长切换法同时测定仙灵骨葆胶囊中淫羊藿苷等5种活性成分含量
范文 冯良 褚书豪 汪小彩



摘要：目的 建立三波长切换法同时测定仙灵骨葆胶囊中淫羊藿苷等5种活性成分含量的方法。方法 采用Waters Atlantis T3 C18色谱柱（250mm×4.6mm，5 ?m）；以乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～5 min，12%～20%A；5～15 min，20%～55%A；15～35 min，55%A；35～55 min，55%～76%A；55.1 min，12%A；55.1～60 min，12%A）；检测波长：0～30 min为212 nm，>30～42 min为246 nm，>42～60 min为270 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min。结果 川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷分别在101.6～3048 ng、8.7～261 ng、7.9～237 ng、117.2～3516 ng、78～2340 ng范围内线性关系良好；仪器精密度、稳定性、重复性试验中RSD均小于3%；平均回收率分别为99.83%、100.35%、100.59%、100.60%、99.72%，RSD均小于3%。结论 该测定方法准确度、灵敏度高，分离效果理想，可为完善仙灵骨葆胶囊质量评价标准提供依据。
关键词：仙灵骨葆胶囊；淫羊藿苷；川续断皂苷Ⅵ；补骨脂素；异补骨脂素；朝霍定C
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.016
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0068-04
Simultaneous Determination of Epimedium Glycoside and Other 4 Kinds of Active Ingredients in Xianling Gubao Capsules by Three Wavelength Switching Method FENG Liang， CHU Shu-hao， WANG Xiao-cai （Pharmacy Department， Third Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450008， China）
Abstract： Objective To establish the method for simultaneous determination of epimedium glycoside and other 4 kinds of active ingredients in Xianling Gubao Capsules by three wavelength switching method. Methods An Waters Atlantis T3 C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 ?m） was used with the mixture of acetonitrile-0.05% formic acid solution as the mobile phase in gradient elution （0–5 min， 12%–20% A； 5–15 min， 20%–55% A； 15–35 min， 55% A； 35–55 min， 55%–76% A； 55.1 min， 12% A； 55.1–60 min， 12% A）. Detection wavelength was as follow： 0–30 min， 212 nm； 30–42 min， 246 nm； 42–60 min， 270 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃. Results The calibration curves of asperosaponin Ⅵ， psoralen， angelicin， epimedin C， and icariin were in good linearity among the ranges of 101.6–3048 ng， 8.7–261 ng， 7.9–237 ng， 117.2–3516 ng， 78–2340 ng， respectively. In the instrument precision test， stability test， repeatability test， the RSD was less than 3%. The average recoveries were 99.83%， 100.35%， 100.59%， 100.60%， 99.72%， respectively， and all the RSD were less than 3%. Conclusion The method is sensitive， accurate， and separation effect is good， which can provide a basis for quality evaluation standard of Xianling Gubao Capsules.
Key words： Xianling Gubao Capsules； icariin； asperosaponin Ⅵ； psoralen； angelicin； epimedin C
仙靈骨葆胶囊是淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄6种中药经现代工艺技术制成的胶囊剂，具有滋补肝肾、活血通络、强筋壮骨功效，临床用于骨质疏松和骨质疏松症、骨折、骨关节炎、骨无菌性坏死等病症的治疗[1-3]。目前，仙灵骨葆胶囊的质量主要以淫羊藿苷、补骨脂素、异补骨脂素含量衡量[4-6]，而对其他成分或多种成分同时测定的研究报道甚少。淫羊藿苷、朝霍定C是淫羊藿的主要成分，检测波长270 nm[7-8]；川续断皂苷Ⅵ是续断的主要成分，检测波长212 nm[9-10]；补骨脂素、异补骨脂素是补骨脂的主要成分，检测波长246 nm[11-12]。这5种成分检测波长不一致且差异较大，不能采用常规方法检测。本研究以淫羊藿苷、朝霍定C、补骨脂素、异补骨脂素、川续断皂苷Ⅵ为指标，采用波长切换方法，用RP-HPLC同时测定仙灵骨葆胶囊中5种活性成分含量，旨在拓展仙灵骨葆胶囊的综合质量评价方法。
1 仪器与试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），Sartorius BP211D分析天平（德国赛多利斯集团），KQ-100DA超声仪（昆山市超声仪器有限公司）。
淫羊藿苷对照品（批号073729910）、补骨脂素对照品（批号110739-201115）、异补骨脂素对照品（批号110738-201012）、川续断皂苷Ⅵ对照品（批号111685-201003）、梓醇对照品（批号110808-201210），中国食品药品检定研究院。朝霍定C对照品（批号MUST-13122312），中国科学院成都生物研究所。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。仙灵骨葆胶囊，规格0.5 g×40粒/瓶，国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，批号1509007、1605066、1606007。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
Waters Atlantis T3 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相为乙腈（A）-0.05%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，12%～20%A；5～15 min，20%～55%A；15～35 min，55%A；35～55 min，55%～76%A；55.1 min，12%A；55.1～60 min，12%A）；检测波长：0～30 min为212 nm，>30～42 min为246 nm；>42～60 min为270 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min。5种成分色谱峰的分离度均大于1.5，理论塔板数按淫羊藿苷峰计算不低于5000。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
分别精密称取川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷对照品适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得浓度分别为2.54、0.87、0.79、2.93、1.95 mg/mL各对照品贮备液。精密量取各对照品貯备液适量，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液，浓度分别为101.6、8.7、7.9、117.2、78 mg/mL，即得。
2.3 供试品溶液制备
取本品约0.4 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加60%甲醇50 mL，精密称定，超声（频率40 kHz，功率100 W）处理30 min，冷却后精密称定，用60%甲醇补足减失质量，摇匀，0.45 ?m滤膜过滤，即得。
2.4 阴性对照溶液制备
按仙灵骨葆胶囊处方制备缺淫羊藿、续断、补骨脂的粉末，按“2.3”项下方法制备，即得。在上述色谱条件下测定，结果川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷相应的保留时间无干扰。
A
B
C
注：A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；
1.川续断皂苷Ⅵ；2.补骨脂素；3.异补骨脂素；4.朝霍定C；5.淫羊藿苷
图1 仙灵骨葆胶囊中5种成分HPLC图
2.5 线性关系考察
精密吸取1、5、10、15、20、30 ?L混合对照品溶液，注入色谱仪，以进样量为自变量，峰面积为因变量，绘制标准曲线，结果见表1。
2.6 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液10 ?L，按上述色谱条件测定，以各峰面积分别计算，川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷RSD分别为1.56%、1.79%、1.86%、0.47%、0.89%（n=5）。
2.7 稳定性试验
精密吸取供试品溶液（样品批号1509007），于0、4、8、10、12、24 h进样10 ?L进行含量测定，峰面积RSD分别为0.83%、1.54%、1.43%、0.29%、0.76%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.8 重复性试验
取同一批样品（批号1509007），制备供试品溶液，共6份，进样10 ?L，以外标一点法计算含量，结果分别为8.31、0.82、0.87、11.85、6.53 mg/g。
2.9 加样回收率试验
取样品（批号1509007），共9份，每份约0.2 g，精密称定，按照样品中川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量一半的80%、100%、120%比例精密加入各对照品贮备液，再按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表2～表6。
2.10 样品含量测定
取3个批号仙灵骨葆胶囊样品，制备供试品溶液，并在上述色谱条件下进样测定，以外标一点法计算仙灵骨葆胶囊中5种成分的含量，结果见表7。
3 讨论
仙灵骨葆胶囊处方中，淫羊藿为君药，2015年版《中华人民共和国药典》对淫羊藿的质量控制指标为淫羊藿苷，但朝霍定C在淫羊藿中含量较大，若仅以淫羊藿苷作为考察指标则有片面性，因此，本研究采用淫羊藿苷和朝霍定C含量共同监测仙灵骨葆胶囊中淫羊藿的内在质量。补骨脂素及异补骨脂素均为补骨脂的指标性成分，川续断皂苷Ⅵ是续断的指标性成分，同时对川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷5种成分进行含量测定，为仙灵骨葆胶囊质量标准提升提供了依据，具有一定实用价值。
本试验探讨了水、10%甲醇、20%甲醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇及甲醇提取溶剂对样品中的川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量的影响，结果显示，以60%甲醇为提取溶剂既能保证提取完全，又能兼顾5种成分含量，故选取60%甲醇作为提取溶剂。同时，比较了不同超声处理时间（10、20、30、45、60 min），结果显示，超声30 min时5种成分含量已经达到了最大值，因此，选择超声处理时间为30 min。
在流动相系统的考察中，对比甲醇-水系统、乙腈-水系统，甲醇具有强的氢键作用能力，可在固定相材料表面与水竞争吸附从而干扰吸附水层的形成，严重缩短样品分子的保留时间，因此，流动相使用乙腈-水；此外，调节了流动相的pH值，发现流动相为乙腈-0.05%甲酸溶液系统效果较为理想，分离效果俱佳，分离度均大于1.5，能完成对川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷的分离，各峰的对称因子均在0.95～1.05之间。
仙灵骨葆胶囊中川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷5种成分的紫外吸收行为各不相同，通过对各对照品溶液在200～400 nm范围内进行全波长扫描，结果显示，川续断皂苷Ⅵ在212 nm、补骨脂素和异补骨脂素在246 nm、朝霍定C和淫羊藿苷在270 nm处有最大吸收，按照5种成分在色谱上的保留行为即保留时间，将检测波长设定为212 nm（0～30 min）、246 nm（30～42 min）、270 nm（42～60 min），3个波长实现切换，同时满足5种成分的定性及定量测定。
对3批仙灵骨葆胶囊中淫羊藿苷等5种活性成分的含量进行测定，结果显示，3批样品川续断皂苷Ⅵ、补骨脂素、异补骨脂素、朝霍定C、淫羊藿苷含量差异较小，说明工艺较为稳定、成熟。
综上所述，本试验建立了不同波长切换法同时测定仙灵骨葆胶囊中淫羊藿苷等5种活性成分含量的方法，该方法灵敏、准确，分离效果较好，无干扰，可为完善仙灵骨葆胶囊质量评价标准提供依据。
参考文献：
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（收稿日期：2017-03-24）
（修回日期：2017-04-01；編辑：陈静）
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更新时间：2025/4/11 11:13:05