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标题 和于泰辅助降糖片联合二甲双胍对糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响
范文 许光远 孙文 宋紫临 郭璇 吴丽丽 秦灵灵 侯丹 张茁 田硕 李响 刘铜华



摘要：目的 观察和于泰辅助降糖片联合二甲双胍对糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗的影响，探讨其作用机制。方法 6～7周龄雄性ZDF（fa/fa）大鼠随机分为模型组、二甲双胍组、和于泰辅助降糖片组（降糖片组）、和于泰辅助降糖片联合二甲双胍组（联合组），另选ZDF（fa/+）大鼠为正常组，各给药组给予相应药物灌胃，连续6周。检测体质量、空腹血糖（FBG）、三酰甘油、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA）、血清胰岛素水平，计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），并进行口服葡萄糖耐量实验（OGTT）；HE染色观察骨骼肌病理变化；RT-PCR和Western blot分别检测骨骼肌相应基因和蛋白表达。结果 与二甲双胍组、降糖片组比较，联合组大鼠TC、FFA、FBG水平及HOMA-IR显著降低（P<0.05，P<0.01）；OGTT各时间点血糖水平及曲线下面积显著降低（P<0.05，P<0.01）；HE染色肌纤维排列整齐，细胞核无增多及内移，未见明显炎细胞浸润；骨骼肌胰岛素受体（InsR）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖转运蛋白4（Glut4）mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；骨骼肌磷酸化InsR、磷酸化Akt、Glut4蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。结论 和于泰辅助降糖片联合二甲双胍能够改善2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗，效果优于单独应用。
关键词：和于泰辅助降糖片；二甲双胍；联合应用；PI3K/Akt信号通路；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.010
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0039-05
Abstract： Objective To observe effects of Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets combined with metformin in insulin resistance （IR）； To discuss its mechanism of action. Methods 6–7 week old male ZDF （fa/fa） rats were randomly divided into model group， metformin group， Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group （Jiangtang Tablets group）， and metformin combined with Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group. ZDF （fa/+） rats were chosen as normal group. Each medication group was given relevant medicine for gavage for 6 weeks. Body weight， FBG， TG， TC， FFA， FINS， HOMA-IR， OGTT and HE staining were tested. HE staining was used to observe the pathological changes of skeletal muscle. RT-PCR and Western blot were used to detect skeletal muscle corresponding gene and protein expression. Results Compared with Jiangtang Tablets group and metformin group， TC， FFA， FBG， and HOMA-IR in metformin combined with Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）. Blood glucose level and AUC significantly decreased at each time point in OGTT. HE staining of skeletal muscle fibers arranged in order； nucleus increased and internal movement was not significant， without obvious infiltration of inflammatory cells. Expressions of skeletal muscle InsR， Akt， and Glut4 mRNA expression increased （P<0.05， P<0.01）. Expressions of skeletal muscle p-InsR， p-Akt， and
Glut4 protein expression increased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets combined with metformin can improve IR in type 2 diabetic rats， and the effect is better than single-application.
Key words： Heyutai Fuzhu Jiangtang Tablets； metformin； combination-application； PI3K/Akt signaling pathway； rats
胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）作为2型糖尿病的主要发病基础越来越受到研究者重视。骨骼肌是胰岛素作用的主要外周靶组织，调节葡萄糖摄取和利用，在IR发生发展过程中起重要作用。二甲双胍是目前治疗2型糖尿病的一线用药，一方面可以提高胰岛素敏感性而促进骨骼肌、脂肪组织对外周葡萄糖的摄取、利用，达到降糖、改善IR作用，另一方面能夠抑制肝、肾过度的糖异生，促进葡萄糖无氧代谢。但二甲双胍单独应用往往疗效不理想，并且会出现胃肠道不良反应、增加乳酸中毒的风险[1]。和于泰辅助降糖片（苦瓜、桑叶、玉竹、三七、肉桂等提取物）是在临床经验基础上结合现代研究成果创制的，具有激活胰岛β细胞、调节神经内分泌系统、改善肝肾功能等作用。现代药理研究表明，其主要成分苦瓜总皂苷[2-4]、桑叶总黄酮[5-6]、桂皮醛[7-8]、三七总皂苷[9]等有确切降糖、改善IR的作用。本研究采用自发性2型糖尿病动物模型ZDF大鼠，观察和于泰辅助降糖片与二甲双胍联合应用改善ZDF大鼠骨骼肌IR的疗效，并与单独应用相比较，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级雄性自发性2型糖尿病模型ZDF（fa/fa）大鼠24只，6～7周龄，体质量180～200 g；同周龄雄性ZDF（fa/+）大鼠6只，北京维通利华实验技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所SPF级动物实验室。ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008饲料（蛋白质26.85%、脂肪16.71%、碳水化合物56.44%）诱导喂养，ZDF（fa/+）大鼠喂养普通全价营养颗粒鼠饲料。
1.2 药物
和于泰辅助降糖片，0.6 g/片，中生肽灵生物科技有限公司，批号140501；盐酸二甲双胍片，0.5 g/片，中美上海施贵宝制药有限公司，批号20150109。
1.3 主要试剂和仪器
苏木素、伊红染液，北京索莱宝科技有限公司；Trizol Reagent，Life technologies公司；GoScript? Reverse Transcription System、GoTaq? qPCR Master Mix，Promega公司；RIPA裂解缓冲液，北京普利莱基因技术有限公司；磷酸化胰岛素受体（p-InsR）、胰岛素受体（InsR）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、蛋白激酶B（Akt）、葡萄糖转运蛋白4（Glut4）、β-actin抗体，CST公司；羊抗鼠Ⅱ抗，Abcam公司；羊抗兔Ⅱ抗，CST公司；Block one/Block one-P，日本京都Nacalai Tesque公司；ECL发光液，美国BIO-RAD公司。7160型全自动生化仪，日本日立公司；r-911型全自动放免计数仪，中国科技大学实业总公司；E9032型酶标仪，美国Promega公司；Prism7500型PCR扩增仪，美国ABI 公司；BX53型光学显微镜，日本OLYMPUS公司；垂直电泳仪、转移槽，美国BIO-RAD公司；凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司。
2 实验方法
2.1 分组和给药
ZDF（fa/fa）大鼠pumina#5008饲料诱导喂养4周后，尾静脉采血检测血糖，随机血糖≥11.1 mmol/L为成模标准，按体质量和血糖随机分为模型组、二甲双胍组、和于泰辅助降糖片组（降糖片组）、和于泰辅助降糖片联合二甲双胍组（联合组），每组6只；6只健康雄性ZDF（fa/+）大鼠为正常组。二甲双胍组每日给予0.134 g/kg二甲双胍药液灌胃，降糖片组每日给予和于泰辅助降糖片0.64 g/kg药液灌胃，联合组每日给予二甲双胍0.134 g/kg+和于泰辅助降糖片0.64 g/kg药液灌胃。所有药物均用生理盐水配制，给药量为0.01 mL/g体质量，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续6周。
2.2 标本采集
药物干预6周后取材，禁食不禁水12 h，1%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，4 ℃、3500 r/min离心15 min，抽取血清，用于生化指标检测；迅速剖取小腿骨骼肌，一部分放入10%中性福尔马林溶液固定，用于普通光学显微镜检测，另一部分置于不同冻存管，放入液氮冻存，用于Western blot、RT-PCR的检测。
2.3 一般观察
观察各组大鼠一般状态（精神状态、活动情况、毛色等），记录体质量，1次/周。
2.4 生化指标检测
取大鼠血清，全自动生化仪检测空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、游离脂肪酸（FFA），全自动放免计数仪检测血清胰岛素水平（FINS），计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR，FBG×FINS÷22.5）。
2.5 口服葡萄糖耐量实验
实验第6周，大鼠禁食不禁水12 h，2 g/kg体质量葡萄糖溶液灌胃，尾静脉取血，葡萄糖氧化酶法测定0、30、60、120 min血糖，计算曲线下面积（AUC）。AUC=0.5×（Bg0 min+Bg30 min）÷2+0.5×（Bg30 min+Bg60 min）÷2+1×（Bg60 min+Bg120 min）÷2，Bg为各时间点血糖。
2.6 HE染色
10%中性福尔马林溶液骨骼肌固定>48 h，常规石蜡包埋，切片（厚度4 μm），常规二甲苯、梯度乙醇脱蜡至水，苏木精染液5 s，自来水返蓝10 min，1%HCl-Alc分色30 s，自来水返蓝10 min，双蒸水洗1 min，伊红染液5 s，乙醇、二甲苯脱水，中性树胶封片。光镜下观察骨骼肌病理变化。
2.7 RT-PCR检测
取液氮冻存骨骼肌，Trizol法提取总RNA。GoScript? Reverse Transcription System试剂盒反转录，退火25 ℃、5 min，延伸42 ℃、1 h，灭活70 ℃、15 min，得cDNA。引物序列：InsR上游5'-GGCCC GATGCTGAGAACA-3'，下游5'-CGTCATTCCAAAG TCTCCGA-3'，产物长度214 bp；Akt上游5'-ATGTAG ACTCTCCAGATGAG-3'，下游5'-TGAGATAATCGA AGTCATTCA-3'，产物长度228 bp；Glut4上游5'-CG CGGCCTCCTATGAGATAC-3'，下游5'-CCTGAGTA GGCGCCAATGA-3'，產物长度270 bp；GAPDH上游5'-GGAAGCTCCGGGAACAAGT-3'，下游5'-TGCCA GCCCATGGATTCTC-3'，产物长度146 bp。GoTaq? qPCR Master Mix 20 μL体系，置于Applied Biosystems 7500 RT-PCR System进行反应，条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，共40个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、15 s溶解。扩增后得出基因Ct值，采用2-ΔΔCt法计算基因表达量。
2.8 Western blot检测
取液氮冻存骨骼肌，以RIPA裂解液提取总蛋白，加上样缓冲液100 ℃、5 min蛋白变性；凝胶电泳100 V、1.5 h，预处理PVDF膜及滤纸，半干法转膜15 V、1 h，TBS溶液洗膜10 min；Blocking one/Blocking one-P封闭30 min，一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜，洗膜后二抗（1∶10 000稀释）室温孵育1 h。洗膜，ECL发光液显影，凝胶成像系统成像，蛋白条带用Image J 7.0进行图像分析。
3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，组间比较方差齐用LSD法检验，方差不齐用非参数检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般状况
正常组大鼠精神良好，反应灵敏，动作灵活，皮毛光泽；模型组大鼠较正常组体质量显著增加（P<0.01），并出现多饮、多尿、多食、皮毛无光泽；各给药组表现较模型组明显改善。各组体质量结果见表1。
4.2 生化指标检测结果
与正常组比较，模型组大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清FBG、TG、TC、FFA、Fins水平和HOMA-IR显著降低（P<0.05，P<0.01）；联合组较二甲雙胍组、降糖片组大鼠血清TC、FFA、FBG水平和HOMA-IR显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表1。
4.3 口服葡萄糖耐量实验结果
与正常组比较，模型组大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC显著降低（P<0.05，P<0.01）；与联合组比较，二甲双胍组、降糖片组大鼠0、30、60、120 min血糖水平及AUC显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。
4.4 HE染色结果
正常组大鼠骨骼肌肌纤维排列整齐、胞浆均匀，细胞核排列正常、形态规则；模型组大鼠骨骼肌纤维排列紊乱，胞浆不匀，细胞核紊乱、增多并出现核内移，见少量炎细胞浸润；各给药组大鼠骨骼肌肌纤维较模型组排列整齐，细胞核增多及内移不显著，未见明显炎细胞浸润，其中二甲双胍组、联合组改善较明显。结果见图1。
4.5 联合用药对模型大鼠骨骼肌胰岛素受体、蛋白激酶B、葡萄糖转运蛋白4 mRNA表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组InsR、Akt、Glut4 mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；与联合组比较，二甲双胍组、降糖片组InsR、Akt、Glut4 mRNA表达显著降低（P<0.05，P<0.01）。结果见表3。
4.6 联合用药对模型大鼠骨骼肌p-胰岛素受体、p-蛋白激酶B、葡萄糖转运蛋白4蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01）；联合组大鼠骨骼肌p-InsR、p-Akt、Glut4表达较二甲双胍组、降糖片组显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表4、图2。
5 讨论
IR是胰岛素作用的靶器官对胰岛素敏感性降低，导致组织中葡萄糖摄取和利用率下降的一种病理状态，是2型糖尿病主要病理基础之一。中药在治疗2型糖尿病、改善IR方面具有多靶点、多途径、疗效稳定、不良反应小等特点。为了更好地探索中西药联合应用治疗2型糖尿病IR的效果，本研究对和于泰辅助降糖片、二甲双胍单独和联合应用的效果进行比较，结果显示，各给药组大鼠血清TG、TC、FBG、FINS水平及HOMA-IR较模型组降低；联合组较二甲双胍组、降糖片组大鼠血清TC、FBG水平及HOMA- IR降低，说明和于泰辅助降糖片、二甲双胍在降低大鼠血糖、改善IR方面联合应用效果优于单独应用。
骨骼肌是机体葡萄糖氧化利用的主要场所，同时也是胰岛素作用的主要靶组织之一，对糖尿病发生发展有重要影响。骨骼肌对葡萄糖的摄取利用主要通过细胞内的胰岛素信号传导通路发挥作用。InsR是细胞内胰岛素信号传导通路的始动因子，分布于细胞表面，与胰岛素结合后发生磷酸化并激活下游分子。研究发现，InsR表达升高能够明显降低小鼠血糖和胰岛素水平[10]，改善IR。Akt是InsR下游的信号分子，被活化的InsR激活后发生磷酸化，从而被激活[11]，活化后的Akt触发富含Glut4的囊泡向细胞表面转位，增多细胞表面Glut4数量，增强骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取[12]，此外Glut4还可以抑制烯醇式丙酮酸羧激酶而减少糖异生[13]。因此，这些靶点分子在胰岛素信号传导中必不可少，任一个分子异常将会导致信号传导不利，影响细胞对葡萄糖的利用及胰岛素敏感性，这是糖尿病、IR发生的基本机制之一。
本研究中以ZDF大鼠为模型，其为自发性2型糖尿病动物模型，更接近人体发病机制，具有高血糖、高血脂、IR的特点。实验中各给药组干预6周后，联合组降糖、改善IR明显优于二甲双胍组、降糖片组，并较二甲双胍组、降糖片组显著上调大鼠骨骼肌InsR、Akt、Glut4 mRNA表达，增加p-InsR、p-Akt、Glut4蛋白表达。因此，和于泰辅助降糖片与二甲双胍联合应用在降糖、改善IR方面疗效优于单独应用，其机制可能是通过上调胰岛素信号通路中InsR、Akt、Glut4的mRNA表达，以及促进InsR、Akt磷酸化和Glut4的蛋白表达，调节胰岛素信号通路而促进骨骼肌细胞葡萄糖代谢。
综上所述，和于泰辅助降糖片与二甲双胍联合应用降糖、改善IR的疗效优于两药单独应用，与其调节胰岛素信号通路关键靶点分子表达相关。由于中药多靶点、多途径发挥作用，中西药联合应用改善IR可能存在其他新机制，需要进一步深入研究。
参考文献：
[1] YASMIN E， GLANVILLE J， BARTH J， et al. Effect of dose escalation of Metformin on clinical features，insulin sensitivity and androgen profile in polycystic ovary syndrome[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2011，156（1）：67-71.
[2] 马春宇，于洪宇，王慧娇，等.苦瓜总皂苷对改善2型糖尿病大鼠IR关键因子的影响[J].中国临床药理学杂志，2015，31（15）：1522-1525.
[3] 肖莹，马春宇.苦瓜总皂苷对3T3-L1IR脂肪细胞炎症因子的影响[J].中药新药与临床药理，2016，27（5）：672-676.
[4] KLOMANN S D， MUELLER A S， PALLAUF J， et al. Antidiabetic effects of bitter gourd extracts in insulin-resistant db/db mice[J]. Br J Nutr，2010，104（11）：1613-1620.
[5] CAI S， SUN W， FAN Y， et al. Effect of mulberry leaf （Folium Mori） on insulin resistance via IRS-1/PI3K/Glut-4 signalling pathway in type 2 diabetes mellitus rats[J]. Pharm Biol，2016，54（11）：2685-2691.
[6] 文静，张德芹，夏佳楠，等.桑叶提取物对MSG肥胖大鼠IR的影响[J]. 天津中医药，2015，32（4）：234-238.
[7] LI J E， FUTAWAKA K， YAMAMOTO H， et al. Cinnamaldehyde contributes to insulin sensitivity by activating PPARδ， PPARγ， and RXR[J]. Am J Chin Med，2015，43（5）：879-892.
[8] SARTORIUS T， PETER A， SCHULZ N， et al. Cinnamon extract improves insulin sensitivity in the brain and lowers liver fat in mouse models of obesity[J]. PLoS One，2014，9（3）：e92358.
[9] 張声生，吴震宇，陈剑明，等.三七总皂苷改善高脂诱导脂肪肝大鼠模型氧化应激及胰岛素抵抗的研究[J].中国中西医结合杂志，2014，34（1）：56-61.
[10] JOO E， HARADA N， YAMANE S， et al. Inhibition of gastric inhibitory polypeptide receptor signaling in adipose tissue reduces insulin resistance and hepatic steatosis in high fat diet-fed mice[J]. Diabetes，2017，66（4）：868-879.
[11] QI J， YANG B， REN C， et al. Swimming exercise alleviated insulin resistance by regulating tripartite motif family protein 72 expression and AKT signal pathway in Sprague-Dawley rats fed with high-fat diet[J]. J of Diabetes Res，2016，2016（2）：1564386.
[12] SALTIEL A R， KAHN C R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism[J]. Nature，2001，414：799-806.
[13] 李娟娥，王磊，孙文，等.匙羹藤对2型糖尿病db/db小鼠骨骼肌葡萄糖转运信号通路的影响[J].现代中药研究与实践，2015，29（3）：37-40.
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更新时间：2024/12/23 2:00:18