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标题 乳乐冲剂对乳腺增生大鼠乳腺组织、性激素及其受体表达的影响
范文 赵娴 候咪 乔迪


摘要：目的 观察乳乐冲剂对乳腺增生大鼠乳腺组织病理学、卵巢性激素及其受体表达的影响，探讨其作用机制。方法 采用肌注苯甲酸雌二醇20 d，再肌注黄体酮5 d建立乳腺增生模型。将66只雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组和中药高、中、低剂量组，每组11只。针刺组选取甲组穴“屋翳”“合谷”（均双侧）、“膻中”，乙组穴“天宗”“肝俞”“足三里”（均双侧），2组穴位交替使用，1组/d；中药各剂量组给予1.1、0.55、0.11 g/mL乳乐冲剂灌胃，1次/d。各组均连续治疗30 d后腹主动脉采血，ELISA检测血清雌二醇（E2）、孕激素（P）含量；同时切除第2对左侧乳房，光镜下观察乳腺组织变化，免疫组化检测乳腺组织雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织增生明显，血清E2含量和ER、PR阳性表达积分显著升高（P<0.01），P含量显著降低（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组大鼠乳腺组织增生均有改善，E2含量和ER、PR阳性表达积分均显著降低（P<0.05），针刺组P含量显著升高（P<0.01），且以针刺组和中药低剂量组作用最为明顯。结论 乳乐冲剂可有效改善外源性雌激素、P所致大鼠乳腺增生组织结构，其机制与降低血清E2含量和乳腺组织ER、PR阳性表达积分，升高血清P含量有关。
关键词：乳腺增生病；乳乐冲剂；针刺；激素水平；受体；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.012
中图分类号：R285.5；R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）11-0048-05
Abstract： Objective To observe the effect of Rule Granules on the breast tissue pathology， ovarian hormone and receptor expression of mammary glands hyperplasia rats； To explore its mechanism of action. Methods The model of mammary gland hyperplasia was established by intramuscular injection of estradiol benzoate for 20 days and intramuscular injection of progesterone for 5 d. 66 female SD rats were randomly divided into 6 groups， including blank group， model group， acupuncture group， TCM high-， medium- and low-dose groups， with 11 rats in each group. Acupuncture group chose group A （Wuyi， Hegu， on both sides， Tanzhong） and group B （Tianzong， Ganshu， Zusanli， on both sides）， and the two groups were used alternately， one group per day. TCM groups received 1.1 g/mL， 0.55 g/mL， and 0.11 g/mL dose of Rule Granules for gavage， once a day. Abdominal aorta blood was collected after continuous treatment of 30 d. The contents of serum E2 and P were detected through ELISA method， at the same time， the second left side of the breast was removed. The changes of the breast tissue was observed under light microscope， and the ER and PR positive expression was observed by SABC immunohistochemical method. Results Compared with the blank group， hyperplasia of mammary gland in the model group rats was more obvious， and serum E2， ER and PR positive expression of integral increased significantly （P<0.01）， but the content of P decreased significantly （P<0.01）； compared with the model group， hyperplasia of mammary gland was improved in all treatment groups， and
基金项目：国家自然科学基金面上项目（81473782）；陕西省中医管理局资助项目（13-LC068）
serum E2， ER and PR positive expression of integral decreased significantly （P<0.05）； the content of P in acupuncture group increased significantly （P<0.01）， and the acupunture group and TCM low-dose group were the most obvious. Conclusion Rule Granules can effectively improve hyperplasia of mammary gland organization structure in rats caused by exogenous estrogen and progesterone， with TCM low-dose group and acupuncture group having the best efficacy. Its mechanism is related to reducing the contents of serum E2 and ER， and PR positive expression in breast tissue， and increasing the content of serum P.
Key words： hyperplasia of mammary gland； Rule Granules；acupuncture； hormone level；receptors； rats
乳腺增生（mammary glands hyperplasia，MGH）是一种既非炎症又非肿瘤的乳腺疾病，是乳腺实质的良性增生，居乳腺病首位，目前临床对MGH尚无特效疗法。国医大师郭诚杰教授及其学术传承人于20世纪70年代开始循序渐进开展了针刺治疗MGH的系列临床及实验研究，并取得可靠疗效[1-3]。郭老治疗MGH除采用针刺治疗外，常配合自创乳乐冲剂口服。为更全面整理、传承郭老治疗MGH的经验，本研究聚焦乳乐冲剂对MGH的治疗作用，通过观察其对MGH大鼠性激素、免疫调节相关物质、乳腺组织病理改变的影响，探讨其治疗MGH的疗效和作用机制，为筛选更有效的针药结合治疗方案，以及研究开发治疗MGH的新药提供实验依据。
1 實验材料
1.1 动物
清洁级SD大鼠雌性未孕66只，80～90日龄，体质量（200±20）g，西安交通大学实验动物中心，动物许可证号SCXK（陕）2012-003。饲养于陕西中医药大学实验中心清洁级动物实验房，室温20～25 ℃，相对湿度40%～70%，通风良好，普通饲料喂养。
1.2 药物
乳乐冲剂（当归10 g，白芍10 g，柴胡9 g，茯苓10 g，青皮9 g，香附9 g，延胡索9 g，莪术9 g，昆布15 g，黄芪15 g，淫羊藿12 g），陕西中医药大学药剂实验室制备。苯甲酸雌二醇注射液，杭州动物药品厂，批号130522；黄体酮注射液，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号130413。
1.3 主要试剂与仪器
苏木素、伊红，雌二醇（E2）、孕激素（P）、ELISA试剂盒和一抗，武汉博士德生物工程有限公司。DIGITAL CAMERADXM 1200正置显微镜（日本Nikon），TL-4型台式离心机（湖南仪器仪表总厂），SHHW21.60A11型恒温水浴锅（上海跃进医疗器械一厂），ZT-12J自动脱水机器（孝感市亚光医用电子技术有限公司），JB-L6包埋机、切片机（武汉俊杰电子有限公司），自动酶标仪（美国BIO-RAD，型号MODEL5500），Motic images Advanced 3.0图像采集分析系统（Nikon DIGITAL CAMERADXM1200F）。0.35 mm×25 mm华佗牌一次性无菌针灸针（江苏医疗用品厂有限公司）。
2 实验方法
2.1 分组
动物适应性喂养1周后，按体质量随机区组分层抽样法分为空白组、模型组、针刺组和中药低、中、高剂量组，每组11只。中药低、中、高剂量组按动物与人临床用药量换算分别给药0.11、0.55、1.1 g/mL。
2.2 造模
参考文献[1，4]方法造模。大鼠后肢外侧肌注苯甲酸雌二醇0.5 mg/（kg·次），1次/d，连续20 d，继而肌注黄体酮5 mg/（kg·次），1次/d，连续5 d。空白组大鼠后肢外侧同法肌注等量0.9%NaCl溶液，1次/d，连续25 d。造模后，模型大鼠出现毛色干枯、摄食减少、易激惹、体质量增加缓慢甚至出现停滞等现象，肉眼观察其乳头高度明显高于空白组。从中随机选择3只，做常规病理切片检查，光镜下见乳腺小叶数增多，小叶腺泡密集、数目增多、弥漫增生、乳腺腺泡和导管大量增生，腺泡腔明显扩张，导管上皮增生明显，说明造模成功。
2.3 干预
针刺组和中药各剂量组从造模成功后第1日起施以相应治疗措施，共30 d。针刺组参考《实验针灸学》[5]，以比较解剖和骨度分寸法为依据选穴。所选穴位分2组，甲组取“屋翳”“合谷”（均双侧）、“膻中”，乙组取“天宗”“肝俞”“足三里”（均双侧）。针刺选用0.35 mm×25 mm毫针，常规消毒后，向外下斜刺“天宗”，向下斜刺“肝俞”，直刺“足三里”，向后（尾侧）平刺“膻中”，向外平刺“屋翳”，向掌直刺“合谷”，深度均为（2.0±0.2）mm；采用捻转手法行针，前后捻转各360°，左右来回为1次，每穴行针100次（约20～30 s），不留针。甲、乙组穴位交替使用，每日1组，1次/d。中药各剂量组按15 mL/kg体质量给药，1次/d，3 mL/次。在施以相应治疗措施的同时，空白组、模型组和中药各剂量组均采用针刺组同法进行抓取固定30 s，空白组、模型组和针刺组灌服等量蒸馏水，均为1次/d。
2.4 标本采集及检测
末次治疗后，禁食24 h。8%硫化钠大鼠乳房周围脱毛。腹主动脉采血，2000 r/min离心15 min，取血清，置于-70 ℃冰箱保存，按ELISA试剂盒说明书操作，同批检测血清E2、P含量。完整剥离并取下第2对左侧乳房，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片（4 μm厚），HE染色，免疫组化检测大鼠乳腺组织雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）表达情况并计算其阳性积分。阳性判断标准参考文献[6]方法并加以改良。镜下观察细胞染色情况，评估染色范围和程度。高倍视野（×40）下计算200个细胞，统计阳性细胞的百分比，≤25%、26%～50%、51%～75%、>75%分别计1、2、3、4分；着色强度按阳性细胞着色无、弱（淡黄）、中（棕黄）、强（棕褐）分别计0、1、2、3分。每张切片随机取5个视野（×400），每个视野均进行阳性细胞百分比计分与着色强度计分，二者相加作为阳性表达积分。
3 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，经方差齐性检验后，多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 不同干預措施对模型大鼠乳腺组织形态的影响
空白组乳腺小叶未见增生，腺泡数量少，腺体大部分处于静止状态，腺上皮细胞排列密集、大小较均匀，腔内未见明显分泌物；模型组乳腺小叶明显增生，大部分腺泡及部分导管呈扩张或极度扩张状态，且充满分泌物，排列较疏松，大小变化明显；各治疗组病理变化较模型组有所改善，乳腺小叶可见增生，与模型组比较，腺泡数量明显减少，导管扩张明显减轻，腔内有少量分泌物及脱落细胞，排列较紧密，细胞大小变化不明显。结果见图1。
4.2 不同干预措施对模型大鼠血清雌二醇和孕激素水平的影响
与空白组比较，模型组E2水平显著升高、P水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组E2水平显著降低（P<0.05），针刺组P水平显著升高（P<0.01），中药各剂量组P水平有所上升；与针刺组比较，中药高剂量组E2水平显著升高（P<0.05），中药各剂量组P水平显著降低（P<0.05）；且中药各剂量组间比较，以中药低剂量组疗效最佳。结果见表1。
与针刺组比较，▲P<0.05；与中药高剂量组比较，△P<0.05（下同）
4.3 不同干预措施对模型大鼠雌激素受体和孕激素受体阳性表达的影响
与空白组比较，模型组ER、PR表达积分均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，各治疗组ER、PR表达积分均显著下降（P<0.05）；与针刺组比较，中药高剂量组ER显著升高（P<0.05），中药各剂量组PR均有所上升；中药各剂量组间比较，以中药低剂量组疗效最佳，见表2。大鼠乳腺组织ER、PR为核表达或浆表达，腺导管和小叶上皮细胞核和或细胞浆着色时为阳性。与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织ER、PR染色范围广、着色更深，表达明显增强，针刺组和中药各剂量组大鼠乳腺组织ER、PR表达均较模型组降低，针刺组和中药低剂量组ER、PR表达更接近空白组。结果见图2、图3。
5 讨论
经过长期大量的临床诊疗实践，郭老对MGH的病因病机和治法有着系统的认识。他认为，肝气郁滞、冲任失调是本病的病理基础，而乳络不通是其病机关键，治疗当以“通”“调”为要，“通”以行乳络、畅气血、化痰瘀、消乳块，“调”脏腑、“调”冲任，脏腑平衡，冲任和调。郭老自创的乳乐冲剂组方正是基于这样的认识。该方由当归、白芍、柴胡、茯苓、青皮、香附、延胡索、莪术、昆布、黄芪、淫羊藿11味药组成，为疏肝理气、化痰软坚、活血止痛之剂。方中柴胡辛散疏肝解郁为君，“肝欲散，急食辛以散之”；配以当归、白芍共为臣药，养血柔肝，缓肝之急，君臣相配，补肝体，助肝用，以疏达肝气；佐以香附、青皮疏肝解郁，调畅气机；延胡索行气活血止痛；淫羊藿补肾壮阳，温阳化湿；昆布消痰软坚、缓消癥块；莪术破血祛瘀，行气止痛；茯苓、炙甘草益气健脾，实脾土以御肝乘，共为佐药。诸药合用，共奏行气活血、消痰化湿、软坚散结，消散乳中结块之效。
本研究选取观测指标为乳腺病理组织形态、血清E2、P含量及ER、PR的表达积分。MGH虽发于局部，但其实质是机体整体功能失调的反映，E2刺激腺管增生，P则促进乳腺腺泡的发育和增生[7]。E2相对或绝对升高、P分泌相对或绝对减少、E2/P比例失调，使乳腺实质增生过度或复旧不全，致乳腺导管与小叶及周围结缔组织的细胞增生，是该病发生的重要原因。E2、P通过ER、PR对乳腺组织发挥生物学效应，激素水平越高，其受体表达越明显[8]。MGH的发生还与乳腺组织局部对E2的敏感性不同有关，乳腺组织ER、PR水平及乳腺组织自身敏感性的升高起着重要作用。有学者认为，局部乳腺组织ER增加，致使组织对E2的敏感性增强也可能是导致乳腺组织增生的重要因素之一[9]。大量研究表明，MGH乳腺组织ER表达均高于正常人，且乳腺增生程度与ER阳性程度呈正相关。而E2具有刺激ER、PR合成的作用，ER、PR可随血液中E2浓度的增加而增加；含量下降的P会使细胞内PR含量下降；当E2水平高于P水平时，细胞内ER、PR会处于较高的水平，反之PR含量则下降。E2与P相互协同，调节细胞内PR含量，结果是明显升高的E2导致细胞内ER、PR含量明显增加[10]。故对MGH治疗的关键正是调整垂体-性腺的激素分泌，纠正激素水平紊乱或调节激素作用的靶点[11]。
本实验结果显示，中药各剂量组均对MGH大鼠性激素有良性调节作用，可使升高的E2水平下降、降低的P水平升高，同时可以抑制其受体（ER、PR）的表达，通过调节性激素水平、降低受体活性，达到抑制乳腺组织增生的疗效。乳乐冲剂低剂量是临床等倍剂量，其疗效接近针刺治疗，且具有更高的安全性。
参考文献：
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更新时间：2024/12/23 1:53:06