| 标题 | 中药材有效部位总黄酮含量测定方法研究概述 |
| 范文 | 包强 刘丽梅 王延玲 毕映燕 摘要：黄酮类化合物为多种中药材有效成分，具有广泛的生物活性和临床应用范围，其种类繁多、成分复杂，仅对某种或若干有效/指标性成分进行定量分析未必能反映其总黄酮量，存在一定局限性。而测定有效部位总黄酮含量是中药材及中药制剂质量控制的重要内容。目前，总黄酮含量测定方法主要有紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法及近红外光谱法等。本文对中药材总黄酮含量测定方法及特点进行综述，为中药材质量控制提供参考。 关键词：总黄酮；中药材；含量测定；综述 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.04.031 中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2018）04-0136-05 Abstract： The flavonoids are the active ingredients of many Chinese materia medica， with widespread biological activities and a wide range of clinical application. There are many types of flavonoids， and its chemical structure is complex. Quantitative analysis of only one or several valid / indexed components may not necessarily reflect the amount of total flavonoids， with some limitations. The content determination of total flavonoids in effective parts of Chinese materia medica is an important aspect of quality control. The main methods for determining total flavonoid content are as follows： UV-visible spectropho-tometry， fluorescence spectrophotometry， high performance liquid chromatography， capillary electrophoresis， thin layer chromatography， as well as near-infrared spectroscopy and so on. In this article， the methods and characteristics in the determination of total flavonoids in Chinese materia medica were reviewed， so as to provide references for the quality control of Chinese materia medica. Keywords： total flavonoids； Chinese materia medica； content determination； review 黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物，系指有2个酚羟基的苯环（A-与B-环）通过中央三碳原子相互连接，一般具有C6-C3-C6骨架结构[1]。黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗炎抗过敏、预防心血管疾病、调节免疫功能、止血止痛、抗菌抑菌等作用，是一类生理活性强、药理作用广泛的化合物[2]。 由于中药材所含的有效成分数量繁多，結构复杂，且部分含量较低，分离条件较难摸索，仅对某种或若干有效/指标性成分进行定量分析未必能反映其总黄酮量，存在一定局限性。中药为具有涌现性特征的复杂系统[3]，测定有效部位的含量作为中药材质量控制中定量的一种手段，符合中药材质量控制的自身特点，具有较好的合理性和可靠性。目前，黄酮类有效部位含量测定的方法主要有紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、荧光分光光度法、薄层色谱法、毛细管电泳法，以及近年兴起的近红外光谱法等，兹就各方法在总黄酮含量测定方面的应用特点进行综述，为以黄酮类化合物为主要成分的中药材的质量控制研究提供参考。 1 紫外-可见分光光度法 黄酮类化合物的甲醇溶液在200～400 nm波长范围内产生2个主要特征吸收带，即240～280 nm（带Ⅱ）和300～400 nm（带Ⅰ），由于分子结构的差异，不同类型黄酮化合物的带Ⅰ和带Ⅱ峰形和吸收强度各异[4]。各种类型的黄酮分子结构上多有酚羟基取代，在碱性条件下，2个吸收峰带可发生红移[5]，利用这一光谱性质，可在其紫外波谱最大吸收波长处测定总黄酮的含量。 1.1 比色法 比色法是最经典的测定中药材/中药制剂中总黄酮含量的测定方法，也是历版《中华人民共和国药典》测定总黄酮广泛采用的方法。该法是在碱性环境中，黄酮类化合物与金属盐类反应形成有色螯合物，生成的螯合物在紫外-可见光光谱上能产生明显的波谱变化，使吸收峰红移，可用来测定总黄酮的含量。常用的金属盐试剂离子有Al3+、Mg2+、Zr2+、Sr2+等。 1.1.1 Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法 该法为历版《中华人民共和国药典》测定中药材/中药制剂总黄酮应用频率最高的方法，系用还原剂NaNO2还原黄酮化合物，再用络合剂Al3+进行络合，最后在NaOH碱性条件下黄酮类化合物开环，生成查尔酮结构络合物而显色，可在500～510 nm处进行测定。常飞等[6]以芦丁为对照品，采用Al（NO3）3-NaNO2- NaOH比色法，在505 nm处对贵州产白补药中总黄酮含量进行测定，考察显色剂的用量及显色时间对试验结果的影响，发现显色剂Al（NO3）3、NaNO2、NaOH的用量对吸光度存在一定影响。刘东彦等[7]采用该法在510 nm处对雪松松针中总黄酮进行大孔树脂纯化，并测定其含量，显色条件为5%NaNO2 0.3 mL（静置6 min），10%Al（NO3）3 0.3 mL（静置6 min），4%NaOH 4 mL（静置15 min）。 1.1.2 AlCl3比色法 Al3+与黄酮母核上的3-羟基、4-羟基和B环邻二酚羟基作用时发生络合反应，使峰带Ⅱ红移至420 nm左右，可在此最大吸收波长处进行测定。徐灵源等[8]以芦丁为对照品，采用AlCl3-HAc-NaAc显示体系，对青天葵中总黄酮进行测定，检测波长为405 nm。考察了显色体系不同的pH条件，确定了偏酸性的缓冲体系HAc-NaAc（pH 5.5）。在该条件下，青天葵中黄酮的5-羟基、4-羰基极易与Al3+络合，在405 nm处呈现吸收。 Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法中，只有黄酮类化合物中有邻二酚羟基，且邻二酚羟基的邻位没有被取代，才会在510 nm左右呈现吸收，值得注意的是，一些具备3，4-邻二酚羟基结构的酚酸、木质素类化合物也可发生显色反应[9]。此外，该显色试剂可能与被测物中某些成分发生沉淀反应，影响测定的准确度。只存在5-羟基、4-羰基的黄酮类物质与AlCl3不发生反应，含有邻二酚羟基的一些化合物，如酚酸、原花色素类在最大吸收波长420 nm左右不产生吸收，故对黄酮类物质测定没有干扰，专属性较强[10]。 1.1.3 HCl-Mg粉比色法 黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等在HCl-Mg粉的作用下，被新生态的氢还原，在有3-羟基或5-羟基的情况下，与Mg2+发生络合生成橙色到暗红色物质，在可见区产生吸收[10]。党晓芳等[11]对鬼箭羽总黄酮含量测定，筛选Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法、AlCl3比色法与HCl-Mg粉比色法，结果表明采用Al3+离子显色剂，对照品和供试品在400～700 nm均无相应吸收峰，而采用HCl-Mg粉比色法在524 nm处有较好的吸收，试验考察了Mg粉用量、加热时间等显色条件。该法具有精密度高、重复性好等优势。王建壮等[12]用HCl-Mg粉比色法测定龙血竭中总黄酮含量，比较Al3+金属盐类显色体系与龙血竭的作用，结果也显示HCl-Mg粉比色法专属性高，适用于龙血竭总黄酮的含量测定。 HCl-Mg粉化学反应中产生大量的热量和气体，严格控制反应条件，有利于提高实验的重复性。HCl-Mg粉反应易在15 ℃左右水浴中进行，加入盐酸溶液时逐滴加入，且需不时振摇试管，减缓盐酸与Mg粉反应的剧烈程度，使产生的新生态氢与黄酮类化合物充分反应，且滴加盐酸的时间不宜超过15 min[13]。 1.1.4 KOH比色法 该法是在碱性环境中，黄酮类化合物峰带Ⅱ发生红移，出现较强的吸收峰。刘效栓等[14]采用KOH比色法，在336 nm处，以甘草苷为对照测定甘草渣中总黄酮的含量。试验确定的显示条件为：10%KOH溶液为显色剂，用量为0.5 mL，显色时间为5 min。值得注意的是，羟基蒽醌类化合物也可与碱性溶液发生颜色改变，因此需要加以区别。 1.1.5 三乙胺比色法 袁旭江等[15]为建立毛鸡骨草中总黄酮含量测定的专属方法，筛选总黄酮含量测定常用的对照品芦丁，及芹菜素、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷为对照，考察三乙胺显色法的适用性。显色条件为：选择芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷为对照，50%三乙胺乙醇溶液为显色剂，用量为5 mL，检测波长为400 nm。此法适用于芹菜素黄酮类成分的含量测定，且显色体系中乙醇和水的体积分数对显色具有明显的影响，在具体的试验中应进行考察。 1.1.6 二氯氧化锆比色法 锆盐也是一种测定黄酮含量时使用的一种络合剂，可与其形成络合物，在一定波长下显色，可用以对总黄酮进行含量测定。仇豪文等[16]采用Al（NO3）3- NaNO2-NaOH比色法测定杜仲叶中总黄酮时，由于绿原酸的存在，测定结果偏高或不真实。因此采用2%ZrOCl2甲醇溶液为显色剂，添加HAc-NaAc缓冲液，以芦丁为对照，放置时间为70 min，在440 nm处测定。试验应考察醋酸盐缓冲液的加入体积、放置时间等影响显色的因素。 1.1.7 钼酸钠比色法 钼酸钠在碱性条件下，与黄酮类化合物形成稳定的配合物，在特定吸收波长处吸光度值发生明显变化，可测定黄酮类化合物的含量。张亚超等[17]测定槐叶中总黄酮含量，以芦丁为对照，采用钼酸钠为显色剂，加入4%NaOH溶液，放置时间为15 min，在322 nm进行测定，同时对显色剂的用量和稳定性进行考察。结果表明，采用该法可较好的解决背景吸收的问题。 1.2 差示分光度法 差示分光光度法系用稍高于或稍低于供试品的标准作参比，测量被测样品和参比之间的相对吸光度，该相对吸光度与黄酮类成分在一定浓度范围内存在线性关系，可用来计算总黄酮含量[18]。欧阳坤等[19]测定毛冬青总黄酮含量，以芦丁为对照，平行制备了2份对照溶液，其中1份以2% ZrOCl2乙醇溶液做显色剂进行显色反应，另一份用乙醇稀释作为参比液，在510 nm波长处，通过绘制标准曲线计算出供试品溶液浓度。方法学表明该法可有效消除毛冬青中其他背景杂质的干扰，操作简便，准确度较高。 1.3 双波长分光光度法/三波长分光光度法 当黄酮类化合物提取液中存在较高含量的叶绿素、原花色素时，常用的比色法测定准确度较低。双波长分光光度法采用2个不同的波长同时测定相同样品，最大程度克服样品本身杂质产生的干扰。以芦丁为对照品，选取510 nm为蒲公英总黄酮的测定波长，590 nm为参比波长，在上述2种波长处采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH比色法测定吸光度，以吸光度差值ΔA与浓度进行线性回歸，折算供试品浓度。结果表明，该方法的测定值低于单波长510 nm处测定值，灵敏度高，专属性较强[20]。应用双波长分光光度法，需正确地选择检测波长和参比波长，常用的方法是系数倍率法。 三波长分光光度法可有效消除光谱吸收峰不对称给定量分析造成的干扰，校正基于干扰组分的吸收光谱具有线性吸收产生的基线倾斜[21]。药用百合总黄酮[22]的含量测定中，以芦丁为对照品，采用AlCl3显色，在200～600 nm波长范围内紫外扫描绘制吸收曲线，作图法确定3个波长为245、323、420 nm，分别测定其吸光度，计算ΔA，以空白试剂参比，依标准曲线计算总黄酮的含量。该方法结果准确可靠，适用于药用百合中总黄酮的含量测定。三波长分光光度法在排除被测物的干扰、提高测定的准确度和灵敏度方面具有优势。 1.4 直接测定法 黄酮类化合物结构各异，某些黄酮应用常规的显色剂在特定的波长下并未出现相应的吸收，或与对照品吸收曲线峰形和最大吸收波长差异较大。近年来，许多研究者采用紫外-可见分光光度法直接测定某些药材中总黄酮的含量。笔者在黄芪和红芪总黄酮的测定中以药材中所含的毛蕊异黄酮葡萄糖苷为对照，在260 nm波长处直接测定总黄酮的含量，方法学验证符合含量测定的要求[23]。川麦冬总黄酮[24]、陈皮总黄酮[25]等含量测定均采用直接测定法。 紫外-可见分光光度法虽然专属性不强，未必能客观反映药材中总黄酮的真实含量，但在现阶段技术水平下，对于成分繁杂的中药材和中药制剂，在未能建立专属可靠的分析方法时，紫外-可见分光光度法仍然不失为是一种简便、适用性强的测定方法。 2 荧光分光光度法 荧光分光光度法具有高灵敏度和选择性，检测限低的优势。中药材中某些黄酮类化合物可与Al3+、Mg2+、Zr2+等金属离子类试剂产生荧光络合物，吸收特定波长的紫外光后可发射一定波长的荧光，且荧光强度与被测物的浓度存在线性关系，可用来测定总黄酮的含量。马登磊等[26]测定元宝枫叶总黄酮含量，以芦丁为对照品，HAc-NaAc缓冲液（pH5）条件下，5%Al（NO3）3为显色剂，激发波长和发射波长分别为470 nm和547 nm。试验考察了乙醇的体积分数、显色剂的加入量、pH值、放置时间及绿原酸对荧光强度的干扰等因素。表明该法可通过改变激发光的波长，减少绿原酸的干扰，提高测定的专属性和准确性。 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法多用于单体成分或若干指标性成分的含量测定，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高等优势，目前已广泛应用于中药材或制剂的含量测定。任冰如等[27]采用反相高效液相色谱法测定红凤菜中总黄酮的含量。将药材所得的甲醇提取物进行酸解成苷，以槲皮素、山柰酚为对照品，测定出二者的含量，再利用前期研究确定的红凤菜黄酮苷的种类及其分子量确定的系数转换法换算成总黄酮的含量。试验结果表明，此法专属性强，数据更为可靠。对淫羊藿总黄酮的含量测定中，陈肖家等[28]比较了紫外分光光度法和高效液相色谱法，并进行了方法学验证，结果显示2种测定方法差异明显，紫外分光光度法测量值远高于高效液相色谱法，提示前者的准确性有待于进一步考证。高效液相色谱法测定有效部位的含量，需要利用转换系数或校正因子对测定的数据进行处理计算，再换算成被测物中总黄酮的含量。 4 近红外光谱法 近红外光谱分析技术具有快速、高效、无损、原位与环保等特点，为中药质量的快速分析提供了一种新的简便预测方法，目前已逐渐应用于中药材及中药制剂的定性、定量分析及在线监测[29]等。胡小莉等[30]以芦丁为对照，采用改良的NaNO2-AlCl3-NaOH比色法对6个不同产地野菊花中总黄酮进行含量测定作为参考值，近红外漫反射光谱法采集样品野菊花的红外图谱。采用偏最小二乘法建立总黄酮含量的定量预测模型，并对该模型进行了验证。经过验证，分析模型相关系数、校正均方差、预测均方差及交叉预测均方差均符合方法学要求，验证集中总黄酮含量近红外预测值平均相对偏差为2.08%，表明近红外光谱法预测结果准确度高，适用性强。 近红外光谱分析方法由近红外光谱仪、化学计量学方法测定结果的软件技术及针对分析样品建立的校正模型3个部分组成[31]。多元线性回归、主成分回归和偏最小二乘法是中药含量测定分析中常用的建立校正数学模型的方法[32]。 5 其他方法 高效毛细管电泳法具有电泳和色谱的双重技术优势，在同时测定若干种黄酮类化合物的含量中也有一定的应用[33]，与高效液相色谱法比较，毛细管电泳法样品前处理过程简单，分析速度快，但是准确度和灵敏度稍低，在总黄酮含量测定方面鲜有报道。此外，单扫示波极谱法、共振散射光谱分析法、薄层扫描法等方法在测定总黄酮方面也有相关报道[34-36]，但是这几种测定方法目前应用较少。 6 小结 近年来，分析测试理论与技术有了长足发展，可供选择的中药材对照品种类日益增多，中药总黄酮定量测定方法发展较为迅速。紫外分光光度法操作简便，比色试剂较多，适用范围较广，为历版《中华人民共和国药典》应用最为普遍的测定中药材或中药制剂总黄酮含量的方法。需要注意的是，应用比色法时，显色系统溶剂的类型和体系的pH值对吸收带的位置具有较大的影响，应注意考察。高效液相色谱法应用范围逐渐扩大，已用于银杏叶总黄酮醇苷、淫羊藿总黄酮定量测定[37]。近红外光谱法近年来发展最为迅速，为中药材及中药制剂的含量测定及生产过程中的在线监测提供了有效手段，满足了中药大批量快速检测的要求。 每种中药材总黄酮含量测定方法均具有一定的适用范围和局限性，在实际研究中，应尽可能全面查阅相关文献资料，尽量明确待测物所含黄酮成分的类型和比例，提高含量测定方法的专属性。对照品应尽量选被测物自身所含的黄酮类化合物，首选已明确的药材中的活性成分，以确保对药材含量测定的可控性。对于药材成分尚不明确或对照品不易得到的，可选择芦丁或槲皮素。应用比色法测定时，应保证测试样品干扰的最大程度排除和吸光度測定值相对稳定，注意样品制备过程中显色参数的优选。应根据不同测定方法的特点和适用范围综合比较，筛选专属性强和准确度较优的测定方法，为含黄酮类化合物中药的质量控制提供有力的方法支撑。 参考文献： [1] 石任兵，邱峰.中药化学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2016：71. 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