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山萸肉饮片标准汤剂研究

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王晓亚高乐范帅帅王鑫国李军山牛丽颖

摘要：目的 ?制备山萸肉饮片标准汤剂并进行质量研究，为相关研究与药物开发提供参考。方法 ?根据中药饮片标准汤剂制备原则，制备15批不同产地的山萸肉饮片标准汤剂，以莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷作为定量检测指标，计算转移率与出膏率，并建立超高液相色谱（UPLC）特征图谱分析方法。结果 ?15批山萸肉饮片标准汤剂的出膏率为43.9%～48.2%，莫诺苷转移率为55.8%～90.8%，马钱苷转移率为52.8%～68.3%，山茱萸新苷转移率为47.2%～61.6%。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件进行特征图谱分析，标定了13个共有峰，对15批山萸肉饮片及标准汤剂进行相似度评价，其相似度均大于0.9。结论 ?本研究山萸肉饮片标准汤剂制备规范，测定方法准确可靠，能够反映山萸肉水煎制剂的内在质量，可为山萸肉配方颗粒的质量控制提供参考。
关键词：山萸肉;饮片;标准汤剂;配方颗粒;转移率;出膏率;特征图谱
中图分类号：R284.1 ???文献标识码：A??? 文章编号：1005-5304（2019）02-0074-06
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.016
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Abstract： Objective To prepare Corni Fructus standard decoction and conduct research on quality; To provide references for research and development of related medicine. Methods Fifteen batches of Corni Fructus standard decoction were prepared according to the standardization method of TCM decoction pieces. With morroniside， loganin and cornuside as the detection indices， the transfer rate and extraction rate were calculated， and the UPLC characteristic chromatograms analysis method was established. Results According to the measurement of 15 batches of Corni Fructus standard decoctions， the extractum rate was at the range of 43.9%–48.2%， and the transfer rates of morroniside， loganin and cornuside were 55.8%–90.8%， 52.8%–68.3% and 47.2%–61.6%， respectively. Besides， Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze and compare the characteristic chromatograms， and 13 common peaks were determined. The similarity was over 0.9. Conclusion The preparation of Corni Fructus standard decoction is standard. The determination method is reliable and accurate， which can be used to reflect the quality of Corni Fructus standard decoctions and provide references for the quality control of Corni Fructus formula granules.
Keywords： Corni Fructus; decoction pieces; standard decoction; formula granules; transfer rate; extractum rate; characteristic chromatogram
山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，除去杂质和残留果核即为山萸肉，味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、收涩固脱功效，用于眩晕耳鸣、腰膝酸痛、阳痿遗精、遗尿尿频、崩漏带下、大汗虚脱、内热消渴[1]。现代药理研究表明，山萸肉化学成分主要为环烯醚萜、鞣质、挥发油、黄酮类和有机酸等[2-4]，具有抗炎抑菌、抗心律失常、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗血栓、降血糖、降血脂等药理作用[4-7]。
随着制剂工艺的发展，中药配方颗粒的应用日趋广泛，解决了传统汤剂制备和使用不便等问题，具有免煎易服、作用迅速、携带方便、安全卫生等优点[8-9]，但目前配方颗粒仍存在一些问题，如标准不明确、剂量不统一、临床合理性有待进一步论证等[10-11]。为解决中药配方颗粒发展面临的问题，国家药典委员会于2016年发布了《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》，提出标准汤剂的概念，将其作为评价中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。中药饮片标准汤剂是指以中医药理论为指导，选取道地药材或主产区药材，经加工炮制成合格饮片后，参考现代提取方法，经标准化工藝制备而成的单味中药饮片水煎剂[12]。中药配方颗粒的生产工艺参数确定、质量控制方法和指标选择、限度制定等药学研究均须与标准汤剂进行对比，以保证与临床汤剂的质量一致性。本研究依据中药饮片标准汤剂制备要求，选用主产区符合2015年版《中华人民共和国药典》规范的15批山萸肉饮片制备标准汤剂，以莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷为指标成分，计算转移率和出膏率范围，并进行特征图谱研究，为山萸肉饮片标准汤剂质量标准的制定提供依据，并为山萸肉配方颗粒的质量控制和评价提供参考。
1? 仪器与试药
ACQUITY UPLC H-Class系统（PDA检测器），美国沃特世公司;Empower3色谱工作站，美国沃特世公司;LC-15C高效液相色谱仪（SPD-15C型紫外检测器、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C柱温箱），日本岛津公司;Pilot5-8L真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司;TB-215D、BSA224S-CW电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司;JY10001型电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司;RE-3000型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;KQ-250型超声波清洗器（功率250 W，频率40 kHz），昆山市超声仪器有限公司;BJH-W200F型陶瓷自动中药煲（电源220 V、50 Hz，功率300 W，容量3.0 L），广东天际电器股份有限公司;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司。
莫诺苷对照品（批号151215，纯度≥98%）、马钱苷对照品（批号15110202，纯度≥98%）、山茱萸新苷对照品（批号151120，纯度≥98%），成都普菲德有限公司;乙腈（Fisher化学试剂公司）、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。15批山萸肉饮片均由神威药业集团有限公司提供，经河北省药品检验研究院孙宝惠鉴定为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，样品来源见表1。
2? 方法与结果
2.1? 标准汤剂的制备
称取山萸肉饮片100.0 g，煎煮2次。一煎加水800 mL，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min，100目筛网趁热过滤;二煎加水600 mL，武火煮沸，文火保持微沸20 min，100目筛网趁热过滤，合并2次煎液，迅速冷却，50 ℃真空减压浓缩至密度为1.03～1.10，使用密度计和pH计测定流浸膏的密度和pH值，放入冰柜冷冻（-40 ℃）过夜，用冷冻干燥机干燥，即得标准汤剂干燥粉末。按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0800水分测定法第二法（烘干法）测定水分。取山萸肉干粉，每批约1 g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，精密称定，开启瓶盖，于100～105 ℃干燥5 h，将瓶盖盖好，转移至干燥器中，冷却30 min，精密称定，再在上述温度干燥1 h，放冷，称重，至连续2次称重差异不超过5 mg为止，根据减失的质量计算干膏粉水分含量。根据公式[出膏率（%）=冻干粉质量÷饮片质量×100%]计算出膏率，结果平均出膏率为（46.09±2.78）%。15批山萸肉饮片标准汤剂密度、pH值、水分、出膏率测定结果见表2。
2.2? 莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷含量测定
2.2.1? 色谱条件
色谱柱：WondaSil C18（4.6 mm×250 mm，5 ?m）;以0.3%磷酸为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（0～11 min，7%B;11～15 min，7%→11%B;15～30 min，11%→25%B;30～40 min，25%B;40～40.01 min，25%→7%B;40.01～50 min，7%B）;流速：1.0 mL/min;检测波长：240 nm，柱温：30 ℃。
2.2.2? 对照品溶液的制备
精密称取莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷对照品适量，加80%甲醇配制成每1 mL含66.6 ?g莫诺苷、34.9 ?g马钱苷和9.0 ?g山茱萸新苷的对照品溶液，即得。
2.2.3? 供试品溶液的制备
取干膏粉适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得山萸肉标准汤剂供试品溶液;取15批饮片粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得山萸肉饮片供试品溶液。
2.2.4? 方法学考察
2.2.4.1? 线性关系考察
精密吸取对照品溶液2、4、8、12、16、20 ?L，按上述色谱条件测定。以莫诺苷进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明莫诺苷在0.133 1～1.331 2 ?g范围内线性关系良好，回归方程为Y=1.588 2×106X-1.153 1×104，r=0.999 6;以马钱苷进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明马钱苷在0.069 7～0.697 2 ?g范围内线性关系良好，回归方程为Y=1.279 0×106X-4.751 3×103，r=0.999 6;以山茱萸新苷進样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明山茱萸新苷在0.018 0～0.180 0 ?g范围内线性关系良好，回归方程为 Y=1.152 6×106X-5.391 2×102，r=0.999 6。
2.2.4.2? 精密度试验
精密吸取对照品溶液10 ?L，按上述色谱条件连续进样6次，计算得莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷峰面积RSD分别为0.76%、0.81%、0.68%，表明仪器精密度良好。
2.2.4.3? 稳定性试验
精密称取干膏粉约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 ?L，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、18、24 h进样测定，计算得莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷峰面积RSD分别为0.52%、0.62%、0.75%，结果表明，供试品溶液中莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷在24 h内稳定。
2.2.4.4? 重复性考察
精密称取干膏粉6份，每份约0.1 g，按“2.2.3”项下方法制备，精密吸取供试品溶液5 ?L，按上述色谱条件进样，计算得供试品溶液莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷含量RSD分别为0.96%、1.21%、0.72%，表明本法重复性较好。
2.2.4.5? 准确度考察
采用加样回收法，取同一批干膏粉6份，每份约0.025 g，精密称定，精密加入一定体积的莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷对照品贮备液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，每份样品平行测定2次，结果莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷的平均回收率分别为97.75%、102.32%、99.53%，表明本法准确度良好。
2.2.5? 样品含量测定
按上述色谱条件测定15批山萸肉饮片和标准汤剂中莫诺苷、马钱苷、山茱萸新苷的含量，计算转移率。结果见表3。
2.3? 特征圖谱的建立与分析
2.3.1? 色谱条件
采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 ?m）;以0.2%磷酸为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱（0～4 min，6%→10%B;4～6 min，10%B;6～15 min，10%→25%B;15～16 min，25%→70%B;16～18 min，70%B;18～19 min，70%→6%B;19～25 min，6%B）;流速：0.3 mL/min;检测波长：240 nm;柱温：35 ℃;进样量：1 ?L。
2.3.2? 对照品溶液制备
精密称取莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷对照品适量，加80%甲醇配制成每1 mL含66.6 ?g莫诺苷、34.9 ?g马钱苷和9.0 ?g山茱萸新苷的对照品溶液，即得。选择莫诺苷峰作为参照峰。
2.3.3? 供试品溶液的制备
取干膏粉约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。
2.3.4? 方法学考察
2.3.4.1? 精密度试验
精密吸取同一份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD均小于3%，表明仪器精密度良好。
2.3.4.2? 稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液，分别于制备0、1、2、4、8、12 h进样，记录各峰的峰面积，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.3.4.3? 重复性试验
精密称取同一批干膏粉（1609062）样品6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液1 ?L，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析并记录各峰的峰面积，计算得各共有峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。
2.3.5? 特征图谱的建立
分别制备15批山萸肉饮片、标准汤剂的供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录16 min色谱图，将所得数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，采用多点校正将谱峰自动匹配，平均数法计算得出样品特征图谱的共有模式，结果。其中，确定了15批山萸肉标准汤剂中13个共有峰，并指认了峰4为莫诺苷，峰9为马钱苷，峰13为山茱萸新苷。
2.3.6? 相似度分析
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》计算特征图谱相似度，结果见表4。15批山茱萸饮片特征图谱的相似度均大于0.96，15批山萸肉标准汤剂特征图谱的相似度均大于0.97，表明15批山萸肉标准汤剂有良好的相似性。比较山萸肉饮片、标准汤剂的特征图谱，对共有峰进行分析可知，山萸肉标准汤剂13个特征峰在饮片中均能得到追踪，表明山萸肉标准汤剂与饮片化学成分基本一致。
3? 讨论
汤剂是应用最广泛的中药剂型。随着剂型现代化的发展，中药出现了配方颗粒、破壁饮片等剂型。目前不同剂型之间存在标准不明确、剂量不统一、质量不均一等问题，陈士林等[12]提出采用中药饮片标准汤剂标化不同用药形式，以提高临床用药的准确性和疗效的一致性。本研究以中医理论为指导，参照国家药典委员会2016年发布的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求（征求意见稿）》和原卫生部、国家中医药管理局2009年印发的《医疗机构中药煎药室管理规范》，利用现代提取设备，采用经标准化工艺制备的山萸肉饮片，以水为提取溶剂，通过物理方法固液分离、低温减压浓缩、冷冻干燥，制得山萸肉饮片标准汤剂。为避免因取样较少引起的误差，并为工业生产提供参考，制备标准汤剂的饮片用量定为100 g;山萸肉为果肉入药，无特殊煎煮要求，故一煎加8倍水，煎煮30 min，二煎加6倍水，煎煮20 min;试验中采用趁热滤过方式进行固液分离，减少成分的损失;趁热滤过后迅速冷却，以减少成分的热分解，同时采用低温减压浓缩、冷冻干燥方法以保证煎液质量的稳定性，最大限度达到与传统汤剂一致的目的。
山萸肉的有效成分在标准汤剂干膏粉制备过程中已被煮提出来，故制备供试品溶液时采用超声溶解即可。本试验对提取溶剂的种类和提取时间进行了考察。分别以60%、80%、100%甲醇作为提取溶剂，结果以80%甲醇提取较完全，故选用80%甲醇作为提取溶剂;选择10、20、30 min进行提取时间考察，结果超声20 min效果最好，故选择20 min进行超声提取。
莫诺苷、马钱苷和山茱萸新苷均为环烯醚萜苷类成分，易溶于水、甲醇，标准汤剂以水为提取溶媒，所以，在山萸肉标准汤剂制备过程中3种成分均具有较高的转移率。
本试验基于HPLC和UPLC建立了山萸肉饮片标准汤剂的含量测定方法及特征图谱分析方法，方法学考察均符合要求，表明本方法稳定可行、重现性良好，含量测定结合特征图谱能够较全面地反映山萸肉水煎制剂的内在质量，可为山萸肉配方颗粒的质量控制和评价提供参考。
山萸肉标准汤剂与饮片特征图谱的主要色谱峰基本一致，其对照特征图谱的相似度達0.99以上，表明山萸肉标准汤剂与饮片主要化学成分基本相同，可为山萸肉配方颗粒替代传统饮片的可行性研究提供参考。
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