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黄连素对人胃癌细胞SGC7901凋亡影响的研究

范文

李舒杨从意鲁艳平徐靖雯胡敬宝

摘要?目的：探討黄连素对人胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法：MTS法检测不同浓度的黄连素（100、150、200?μmol/L）对胃癌细胞的抑制作用，Hoechst?33258染色检测不同浓度的黄连素（100、150、200?μmol/L）对细胞凋亡的影响;Real?Time?Q-PCR检测胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA表达;Western?blot检测胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果：不同浓度的黄连素能显著降低人胃癌细胞SGC701活性（P<0.05，P<0.01），促进其凋亡，升高Cleaved?Caspase-3、Bax的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01），降低Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05，P<0.01）。结论：不同浓度的黄连素可诱导胃癌细胞凋亡，其机制可能与升高Cleaved?Caspase-3、Bax的表达，降低Bcl-2的表达有关。

关键词?黄连素;SGC7901细胞;细胞凋亡;Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax;抗肿瘤;机制研究

Effects?of?Berberine?on?Apoptosis?of?Gastric?Cancer?Cell?Line?SGC7901

LI?Shu1，YANG?Congyi1，LU?Yanping1，XU?Jingwen2，HU?Jingbao1

（1?Bao′an?Hospital?of?Traditional?Chinese?Medicine，Shenzhen?518101，China;?2?Guangzhou?University?of?Chinese?Medicine，Guangzhou?510405，China）

Abstract?Objective：Current?studies?showed?that?berberine?had?a?certain?anti-tumor?effect，but?its?antitumor?mechanism?did?not?have?depth?study?yet.This?study?discussed?that?the?influence?of?berberine?on?human?gastric?cancer?cells?SGC7901′s?apoptosis.Methods：The?inhibition?of?gastric?cancer?cells?induced?by?different?concentrations?of?berberine（150?μM，200?μM，250?μM）was?determined?by?MTS.Hoechst?33258?staining?method?detected?the?apoptosis?of?gastric?cancer?cells?induced?by?different?concentrations?of?berberine（100?μmol/L，150?μmol/L，200?μmol/L）.The?mRNA?and?protein?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bcl-2，and?Bax?of?gastric?cancer?cells?were?assessed?by?Real?Time?Q-PCR?and?western?blot.Results：Different?concentrations?of?berberine?could?significantly?reduce?the?human?gastric?cancer?cells?SGC701′s?activity，promote?its?apoptosis，increase?mRNA?and?protein?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bax，and?reduce?the?mRNA?and?protein?expressions?of?Bcl-2.Conclusion：Different?concentrations?of?berberine?could?reduce?gastric?cancer?cells?apoptosis.The?mechanism?might?be?elevated?the?expressions?of?Cleaved?Caspase-3，Bax?and?reduced?the?expression?of?bcl-2.

Keywords?Berberine;?SGC7901;?Cell?apoptosis;?Cleaved?Caspase-3;?Bcl-2;?Bax;?Anti-tumor;?Mechanism?research

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.011

黄连素（Berberine）是中药黄连的主要提取物，研究证实具有广泛的生物学作用。近年来大量的实验证实黄连素具有抗肿瘤的作用[1]，对肺癌、食管癌、肝癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞有一定的抑制作用。Ahmadiankia等[2]发现，10、20、40、80?μmol/L的黄连素可降低乳腺癌细胞MCF-7的迁移能力，并可下调某些趋化因子受体的mRNA表达水平。研究[3]发现，黄连素可通过抑制N乙酰转移酶活性而抑制肺癌细胞A549的增殖。Yip?NK[4]发现黄连素可通过升高Bax基因的表达降低肝癌细胞的活性，但其对胃癌细胞是否有抑制作用还有待进一步研究。本研究拟以人胃癌细胞SGC7901为靶细胞，观察不同浓度的黄连素对其凋亡发挥的作用，为临床运用提供一些参考。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?细胞?人胃癌细胞株SGC7901由广州中医药大学岭南医学研究中心中医内科实验室赠予。

1.1.2?试剂和仪器?黄连素（纯度≥98%）购自美国sigma公司，批号LRAA9232。1640培养基购自美国Gibico公司，批号LRAA9232;胎牛血清购自美国Biological?Indμstries公司，批号1608796;青霉素、链霉素购自美国Gibico公司，批号1829771;胰酶购自美国Gibico公司，批号1846496。Cleaved?Caspase?3一抗购自Cell?Signaling?Technology公司，批号21;Bcl-2一抗购自R&D?System公司，批号CDVT0116122;Bax一抗购自ABclonal公司，批号9002211001;所有二抗均购自美国ABclonal公司;PCR试剂盒购自瑞士Roche公司，批号16241700。

1.2?方法

1.2.1?细胞培养?人胃癌细胞SGC7901常规置于1640完全培养基，内含10%胎牛血清，1%青霉素、链霉素，在37?℃，体积分数为5%?CO2条件下培养。

1.2.2?MTS筛选黄连素干预SGC7901的最佳浓度取对数生长期的胃癌细胞，制成2×103/mL的单细胞悬液，100?μL/孔接种于96孔板中，边缘用PBS填充，细胞贴壁后吸弃培养液，对照组加入1640培养基100?μL，实验组分别添加含不同浓度黄连素（100、150、200?μmol/L）的培养液100?μL，每组接种10个副孔，分别培养24、48、72?h后，每孔加入MTS/PMS混合液20?μL，继续避光孵育4?h后用酶标仪检测490?nm波长的吸光度。

1.2.3?Hoechst?33258染色检测细胞凋亡情况?取对数生长期的胃癌细胞接种于6孔板中，待细胞长至80%满时吸弃培养液，对照组加入1640培养基2?mL，实验组分别添加含不同浓度黄连素（100、150、200?μmol/L）的培养液2?mL继续培养24?h。吸去培养液后加入固定液，固定5?min，PBS清洗2遍后加入Hoechst?33258染色液，染色5?min，PBS再次清洗2遍后滴一滴抗荧光淬灭液，荧光显微镜下观察结果。凋亡细胞的细胞核、细胞质呈浓染致密荧光，而正常细胞的细胞核、細胞质呈均匀的荧光。

1.2.4?Real?Time?Q-PCR检测胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达?取生长良好的MSC，调整细胞浓度为1×106/mL接种于60?mm培养皿，待细胞长至80%时换液，实验组分别加入含100、150、200?μmol/L黄连素的培养液，对照组只加1640培养基，培养24?h后，用PBS洗细胞3次，采用Trizol法提取总RNA。PCR反应体系：cDNA?5?μL、上游引物（10?μmol/L）0.5?μL、下游引物（10?μmol/L）0.5?μL、2x?SYBR?Green?PCR?Master?Mix?10?μL、dH2O?4?μL，反应条件：95?℃?5?min，95?℃?15?s，60?℃?32?s读板，循环40次，反应完成后，计算机自动分析荧光信号，并将其转换为Ct值，根据2-△△Ct计算Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的相对表达量。引物序列见表1。

1.2.5?Western?blot检测胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达?取对数生长期的胃癌细胞，接种于6孔板内，待细胞长至80%时换液，实验组分别加入含100、150、200?μmol/L黄连素的培养液，对照组只加1640培养基，培养24?h后收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳，电转，封闭后4?℃孵育一抗过夜，TBST洗膜后加入相应二抗稀释液37?℃孵育1?h后显影。并用Image?J软件分析灰度值。

1.3?统计学方法?采用SPSS?23.0统计软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差（±s）表示，采用One-Way?ANOVA检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2?结果

2.1?黄连素对胃癌细胞存活率的影响?不同浓度的黄连素（100、150、200?μmol/L）干预24～72?h后，均对胃癌细胞存活有一定的抑制作用，且伴随作用浓度及作用时间的增加，胃癌细胞的存活率越低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01），表明黄连素对降低胃癌细胞存活率有一定的浓度与时间依赖性。见图1。

2.2?黄连素对胃癌细胞形态的影响?不同浓度的黄连素（100、150、200?μmol/L）干预24?h后，对照组细胞的细胞核边缘光滑整齐，呈均匀的淡蓝染色，黄连素组细胞的细胞核边缘不整齐，核固缩，呈致密浓染，并伴随黄连素的浓度增高，细胞核的改变更明显。见图2。

2.3?黄连素对胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax表达mRNA的影响?与对照组比较，随着黄连素给药浓度的增加，胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bax的mRNA表达水平逐渐升高，Bcl-2的mRNA表达水平逐渐降低，呈明显的浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见图3。

2.4?黄连素对胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响?与对照组比较，随着黄连素给药浓度的增加，胃癌细胞中Cleaved?Caspase-3、Bax蛋白的表达水平逐渐升高，Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低，呈明显的浓度依赖性，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见图4。

3?讨论

胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤，是最常见的消化道恶性肿瘤之一，在全世界有很高的发生率和死亡率[5-6]。研究表明，黄连素的抗肿瘤功能是通过诱导细胞发生凋亡实现的[7]，而细胞的凋亡又与Bcl-2家族和Caspase家族密切相关。

细胞凋亡是各种内外因素作用下细胞发生的程序性死亡过程，是维持机体内环境稳定的重要机制，其与癌症等诸多疾病的发生发展密切相关。诱导肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的重要途径之一[8]。Caspase家族可通过线粒体通路调节细胞凋亡，而Caspase-3是Caspase家族重要的凋亡执行者，属于凋亡执行因子，位于级联反应的下游[9]，活化后的Caspase-3是凋亡进入不可逆阶段的标志[10]。Cleaved?Caspase-3是Caspase-3活化过程中产生的活性片段，其表达水平可反应Caspase-3活性程度及细胞凋亡水平[11]。Bcl-2家族是线粒体通路的重要环节，可调节线粒体外膜的通透性，从而释放细胞色素C，导致细胞凋亡[12]。Bax位于细胞质，其可在凋亡程序启动后助细胞色素C释放，从而激活其下游的Caspase家族，促进凋亡[13]。Bcl-2位于线粒体膜，其作用是稳定线粒体膜，阻止释放细胞色素C，进而抑制凋亡[14-15]。

为了探讨黄连素抑制人胃癌细胞SGC7901的作用机制，本实验首先通过MTS法观察不同浓度黄连素对胃癌细胞活性的抑制作用，随后通过Hoechst?33258染色法观察其对细胞形态的影响，再通过Real?Time?Q-PCR和Western?Blot检测不同浓度的黄连素对胃癌细胞基本和蛋白的表达水平。本实验结果表明，超过100?μM的黄连素可以显著降低人胃癌细胞SGC7901的活性，且有明显的浓度与时间依赖性;黄连素还可以显著上调Cleaved?Caspase-3和Bax的表达，下调Bcl-2的表达，且随着其浓度的升高，表达差异越显著。表明黄连素诱导人胃癌细胞SGC7901凋亡可能是通过活化Bax和Bcl-2，激活Caspase-3通过线粒体途径实现的。

综上所述，黄连素对人胃癌细胞SGC7901增殖有较好的抑制作用，可能通過线粒体途径诱导其凋亡，为中医药在临床的运用提供了新的方向。

参考文献

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（2018-12-04收稿?责任编辑：芮莉莉）

基金项目：广东省青年创新人才类项目自然科学类基金（2016KQNCX018）;高水平大学建设项目（A1-AFD018171Z11087）作者简介：李舒（1990.05—），女，博士，医师，研究方向：中医药防治消化系统疾病，E-mail：suelee525@126.com通信作者：胡敬宝（1965.07—），男，硕士，主任医师，研究方向：中西医结合治疗消化道疾病，E-mail：rzzyhjb@126.com

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