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单细胞测序技术与中医药前沿研究

范文

李捷　唐勇　刘洁

摘要单细胞测序技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序的新技术，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，是研究细胞异质性的有力工具。近十年来涌现出大量基于这项技术的生物细胞异质性研究，应用于肿瘤学、胚胎发育、神经生物学、免疫学等多个研究领域。在中医药领域科研中刚开始崭露头角，已经有利用单细胞测序进行中医方剂、中药作用机制等的科学研究。通过介绍单细胞测序技术概况以及现阶段在医学领域研究中的应用，论述单细胞测序在中医学研究中的可应用方向，拓展中医研究思路和方法，为探索中医药的现代化研究提供了新的支撑，大大加快传统中医药与现代生命科学技术的结合。

关键词单细胞测序概述;单细胞测序应用;方药作用机制;中医诊断原理;针灸作用机制

Abstract Single-cell sequencing technology is a new technique for high-throughput sequencing of genome，transcriptome and epigenome at the level of a single cell.It can reveal the gene structure and gene expression state of a single cell，and is a powerful tool for the study of cell heterogeneity.In the past decade，a large number of researches on biological cell heterogeneity based on this technology have emerged，which have been applied in oncology，embryonic development，neurobiology，immunology and other research fields.In the field of traditional Chinese medicine（TCM） scientific research is just beginning to emerge，there has been the use of single cell sequencing of prescriptions，the mechanism of action of traditional Chinese medicine and other scientific research.Through the introduction of single-celled sequencing technology and its application at present in the field of medical research，discusses the single-celled sequencing in TCM can be used in the study of the direction，to expand the research ideas and methods of TCM，to explore the modernization of TCM research provides new support，greatly accelerate the combination of TCM and modern life science and technology.

Keywords Single cell sequencing overview; Single cell sequencing application; Prescription mechanism; Diagnosis principle of TCM; Acupuncture mechanism

中图分类号：R2-03文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.11.001

中医药是我国传承了五千年的瑰宝，它的疗效及其科学性经住了历史长河的考验，但是由于中医药的理论和作用机制很多都尚不明确，导致中医药还未被世界完全认可，甚至有很多国人都不信任中医药，所以把现代先进科学技术与中医药相结合，进一步探索中医药理论作用机制是发扬中医的重要一环。现代科学对于生命的认识从群体、个体、器官组织水平一直发展到目前的细胞水平乃至分子生物学水平，其研究是一个从宏观到微观，从现象到本质逐层深入的过程。随着基因组计划以及一代、二代转录组研究在器官、组织水平的开展，单细胞水平的基因组和转录组研究逐渐成为关注焦点。在中医药领域研究中，随着分子生物学前沿技术的大量应用，人们已经从多层次、多角度对中医学的辨治理论及方药的作用机制等进行了深入探讨，取得了众多令人瞩目的研究成果。近年来单细胞测序技术应用于中医药研究，已经解决了部分中医科研中遇到的难题。本文介绍了单细胞测序技术及在各个领域中的发现，例举其在中医药研究的应用和探索，讨论了未来中医与单细胞技术结合的思路。

1 单细胞测序技术

1.1 单细胞测序技术概述

单细胞测序技术是指对单细胞基因组或转录组进行测序，从而获得基因组、转录组或其他多组学信息，以揭示细胞群体差异和细胞进化关系。单细胞测序技术主要包括单细胞基因组测序、转录组测序和表观遗传学测序，它们各自有各自的特点，满足了多种科研需求。2009年，Tang等[1]首次通过改进先前用于微阵列分析的单细胞转录组扩增方法，分析了来自小鼠四细胞胚胎阶段的单个卵裂球的转录组。2011年，Islam等[2]建立了单细胞标记的逆转录测序方法，即STRT-seq（Single-cell Tagged Reverse Transcription Sequencing），能够大规模检测各种混合细胞样本。在此之后，2012年，Ramskold等[3]开发了一种新的单细胞测序技术Smart-seq（Switching Mechanism at 5′ end of the RNA Transcript），检测来自单细胞水平的RNA和单个循环肿瘤细胞的全长mRNA，增加了转录本序列的覆盖度。2013年，《科学》（Science）杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《自然方法》杂志将单细胞测序的应用列为年度最重要的方法学进展[4]。2014年，Jaitin等[5]建立了名为MARS-seq（Massively Parallel Single Cell RNA-seq）单细胞测序的方法，该方法可用于分析数千个单个细胞的体内转录状态。2015年，哈佛医学院的研究人员将微流控技术结合纳升级液滴和条码微珠，推出Drop-seq[6]和inDrop[7]技术，微珠直接捕获mRNA，全部反应均在一个液滴中完成，产物浓度更高，且成本大大降低。2017年，Gierahn等[8]提出10xGemCode技术，该技术将条码反应液滴以油滴封装，反转效率更高，可实现数千个免疫细胞的分析。2018年，Han等[9]開发的Microwell-seq是一个高吞吐量、低成本的scRNA-seq平台，提高了单细胞检测技术的丰度，但与涂有油滴的单细胞测序技术相比，它也降低了一个数量级的检测成本。Rosenberg等[10]的SPLit-seq技术基于低成本组合条形码的原理可对数十万个细胞直接捕获，不需要将单个细胞用油滴包裹形成独立的单元极大简化了步骤和节约了成本，实现每个细胞检测成本小于1美分。直到今天单细胞测序技术更加准确、高效、多元化、低成本。到今天，单细胞测序已经广泛用于癌症、胚胎发育、神经生物学和免疫学等多个领域并取得了重大的突破。

1.2 单细胞测序类型

1.2.1 单细胞全基因组测序

单细胞基因组测序是从分离的单细胞中提取DNA后，扩增单细胞的全基因组，通过第二代DNA测序技术进一步进行测序分析[11]。这种测序技术主要用于发现DNA分子水平的异常。不仅可以发现疾病相关的突变，并且可以鉴定突变伴随的细胞亚群，从而为疾病治疗提供更特异的靶点[12]。首先是Navin等[13]通过流式细胞分离，对200个癌细胞分别进行单细胞全基因组测序，研究癌症的进化，发现癌细胞分化过程中的异质性。后来Yang等[14]分别从一名46岁外源性型宫颈癌患者的新鲜肿瘤组织中采集了放疗前和放疗后的宫颈细胞，对每个细胞进行单细胞全基因组测序分析，发现放疗前和放疗后的肿瘤细胞几乎是2个独立的克隆，放疗前的主要亚群被杀死，放疗前的次要亚群成为放疗后的主要亚群。放射治疗后，在肿瘤细胞中POU class 5 homeobox 1B（POU5F1B）中检测到人乳头瘤病毒（HPV）融合位點。结果表明，在POU5F1B中整合HPV的肿瘤细胞在放疗后存活，放疗前后肿瘤细胞表现出明显的特征。这些结果为研究驱动宫颈癌放疗耐药的具体分子事件提供了新的思路。

1.2.2 单细胞全转录组测序

单细胞全转录组测序是从分离出的单细胞中进行单细胞分离和RNA提取后，需要先将捕获到的mRNA逆转录成cDNA，然后通过PCR或其他转录方法对整个转录组进行扩增[8]。该技术在揭示细胞类型、确定细胞亚群、准确反映细胞间的异质性、描述细胞命运谱系等方面发挥了重要作用[15]。Paul等[16]发表在细胞（Cell）杂志上的工作，利用单细胞转录组测序对早期髓系祖细胞群体进行分析，将传统定义的共同髓系祖细胞及其下游的粒系-单核系祖细胞和巨核-红系祖细胞详细划分为18种亚群，并发现其对红细胞、巨核细胞、单核细胞等下游细胞均具有不同程度的转录特异性。近期Dominguez等[17]利用单细胞转录组学，在动物模型中绘制了胰腺导管腺癌（PDAC）进展过程中的成纤维细胞结构，通过转化生长因子和表达含有15（LRRC15）蛋白的富含亮氨酸的重复序列，确定了一组癌相关成纤维细胞（CAFs）。LRRC15* CAFs存在于22例PDAC患者的>80.000个单细胞和70例患者的免疫组织化学标本中，均证实了LRRC15* CAFs存在于人类患者中。此外。由6种癌症类型的600多名患者参与的免疫治疗临床试验显示，LRRC15* CAF的表达水平升高与抗pd-l1治疗的不良反应有关。这项工作对于靶向肿瘤微环境的非免疫元件以促进癌症患者对免疫检查点阻断治疗的反应具有重要的意义。

1.2.3 单细胞表观基因组测序

表观基因组测序主要针对DNA修饰和DNA甲基化和组蛋白修饰等方面进行研究，表观基因组测序可以探索稀有细胞类型的表观基因组变化并破解细胞群体中的表观遗传异质性[18]。Nagano等[19]的Hi-C法是最先被提出的单细胞表观基因组测序方法，可在百万碱基分辨率的基础上识别单细胞水平的染色体相互作测序，引入单细胞Hi-C，结合全基因组的统计分析和单拷贝X染色体的结构建模，以表明单个染色体在巨碱基尺度上保持区域组织，但在更大的尺度上显示可变的细胞间染色体结构，单细胞Hi-C数据在染色体基因组学和显微学研究之间架起了桥梁，展示了动态染色体结构下的模块化组织，以及这种结构与基因组活动模式之间的概率联系。随后，Guo等[20]用单细胞亚硫酸盐测序法（scRRBS）可以检测到单个小鼠胚胎干细胞（mESC）基因组中多达150万个CpG位点的甲基化状态，还可以检测单倍体精子细胞中单个CpG位点的甲基化状态，无论是未甲基化的还是完全甲基化的。此外，还发现，在小鼠受精卵的个体前核内，可以追踪到受精后母体和父方基因组的去甲基化动力学，无论在雄性还是雌性原核中，基因区域的去甲基化过程都比基因间区域的去甲基化过程快。这种方法为探索单个细胞在胚胎发育等生理过程或肿瘤发生等病理过程中的单碱基分辨率的动态甲基化环境铺平了道路。

1.2.4 单细胞多组学测序

近年来，单细胞技术使多组同步测序成为现实，这有助于更详细地阐明单个细胞的基因组、转录组和表观基因组之间的关系。单细胞三重组学测序是利用单个细胞释放到上清液中的mRNA进行转录组测序。然后，用单细胞还原表征亚硫酸氢盐测序法在含有基因组DNA的沉淀中检测DNA甲基化序列和基因拷贝数的变化。最后，可以同时获得单细胞基因组、转录组和DNA甲基化模式的数据以及它们之间复杂的网络关系[21]。如Hou等[22]利用单细胞多组学测序，同时分析单个哺乳动物细胞的基因组拷贝数变异（CNVs）、DNA甲基化组和转录组发现，大规模的拷贝数变异会导致获得或丢失基因组区域内基因RNA表达的比例变化，而这些拷贝数变异通常不会影响这些区域的DNA甲基化。此外，将单细胞多组学测序应用于25个来源于人肝细胞癌组织样本的癌细胞，根据CNVs、DNA甲基化组或单个细胞的转录组鉴定了这些细胞中的2个亚群。单细胞多组学测序在单细胞水平上同时询问其组成成分的基因组、甲基化组和转录组，成为破解发育和癌症中细胞群的异质性和复杂性的有力工具。单细胞多组学测序也可以用来研究肿瘤的进展和转移。近期Bain等[23]优化单细胞多组学测序研究人类结直肠癌细胞，全基因组的DNA甲基化水平在单个遗传亚系中相对一致，然后对10例直肠癌患者的DNA进行了测序，发现其癌细胞的全基因组DNA去甲基化模式是一致的。癌细胞DNA去甲基化程度与正常组织中异染色质相关组蛋白修饰H3K9me3的密度和重复元素长时间穿插的核元素1的密度明显相关，提示DNA甲基化谱在单一遗传谱系或次世代内相对稳定。原发肿瘤和转移瘤DNA甲基化水平的差异可能主要是由亚家族成分的差异引起的，而非转移过程中的去甲基化或去甲基化。由此可以证明用单细胞多组学测序重建遗传谱系和追踪其表观基因组和转录组动力学的可行性。

1.3 单细胞测序技术基本流程

单细胞测序技术是近年来迅速发展的生命科学前沿技术，它在单细胞水平揭示细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性具有独特的优势，为生命科学的研究打开了新的大门。该技术一般流程可分为单细胞分离、核酸扩增、高通量测序、数据分析这几个步骤[24-25]。简要流程见图1。

2 单细胞测序在医学领域中的应用

2.1 肿瘤

首先应用最广的是肿瘤方向的研究，在肿瘤研究中的应用表明，遗传或基因组变异可导致肿瘤组织内具有不同遗传和表型特征的细胞，使肿瘤组织具有高度异质性。这种高度的异质性可能与肿瘤发生和转移的机制有关[26-31]，传统的测序方法只能检测到细胞的数量，得到一组细胞的平均信号，掩盖肿瘤细胞的异质性。单细胞测序技术可以很好的弥补传统测序方法的不足，通过检测肿瘤细胞的异质性，绘制肿瘤细胞与肿瘤微环境的细胞图谱，进一步明确肿瘤组织内的细胞群，寻找特异性标志物，解释肿瘤发生、转移等一系列问题。最早Navin等[13]使用单细胞mRNA测序（scRNA-seq）了解乳腺癌的起源首次单核测序分析基因组拷贝数变异，研究2例乳腺癌患者的肿瘤种群结构和进化。结果在肿瘤中发现了间断的克隆进化，并证实了转移细胞是从主要的晚期扩展中出现的。近期，Zhang等[31]对结直肠癌患者的免疫和基质人群进行了scRNA-seq分析，确定了特异性巨噬细胞和常规树突状细胞（cDC）亚群作为肿瘤微环境中细胞串音的关键递质。在小鼠肿瘤中定义可比较的髓细胞群，能够表征它们对髓细胞靶向免疫治疗的反应。他们使用抗csf1r的具有炎性反应信号的优先耗竭巨噬细胞进行治疗，但保留小鼠和人类中表达促血管生成/致瘤基因的巨噬细胞群，CD40激动剂抗体的治疗优先激活cDC人群，增加Bhlhe40类th1细胞和CD8记忆T细胞。这项发现对人和小鼠关键的骨髓亚群的综合分析确定了调节肿瘤免疫的关键细胞相互作用，并确定了髓样靶向免疫治疗的机制。综上所述，单细胞测序在探究肿瘤的发生和转移具有独特的优势。

2.2 生殖和胚胎医学

单细胞测序技术可以在单细胞水平上对生殖细胞和胚胎细胞的全基因组进行测序和定量，这将有助于了解生殖细胞的发生以及生殖和遗传疾病的筛查、诊断和治疗。单细胞测序用于生殖和胚胎发育领域在鉴定细胞类型、探究细胞异质性、推断细胞发育轨迹方面具有独特的优势。例如Vento-Tormo等[32]用单细胞测序技术对妊娠早期胎盘细胞进行了单细胞转录组分析，并绘制了胎盘细胞图谱。通过细胞图谱发现了位于不同蜕膜层和蜕膜自然杀伤细胞的血管周细胞和基质细胞的3个亚群，且具有独特的免疫调节和趋化特性，揭示了蜕膜和胎盘的细胞组织，以及对胎盘形成和生殖成功至关重要的相互作用。这些发现对了解早期妊娠过程有重要意义。

2.3 神经生物学

在神经系统中，单个神经元之间存在差异，单细胞测序技术可以研究许多不同时期的神经细胞，并绘制详细的单细胞图，以了解和识别大脑中不同类型的神经元及其连接分子[33]。如Luo等[34]通过高通量单细胞甲基化测序将小鼠和人类额叶皮层神经元细胞的亚型分化。他们在人类额叶皮层中发现了一组新的神经元，并基于神经元的甲基化组重新定义了神经元类型。近期Perlman等[35]分析了包括髓鞘形成高峰时间在内的不同年龄段的人类脑组织，发现了3个不同的细胞亚群，包括早期OPC（e-OPC）组、晚期OPC组（l-OPC）和成熟的OL（MOL）组，并将具有阶段特异性功能的少突细胞谱系细胞的转录组特征联系起来，丰富了e-OPCs的基因本体论术语包括细胞周期和發育，l-OPCs包括细胞外基质和细胞黏附，而MOLs包括髓鞘化和细胞骨架。e-OPCs多局限于早幼粒细胞形成的胎儿组，l-OPCs多见于儿童年龄组，与早幼粒细胞形成的高峰年龄相对应。这些发现强调了醇系细胞在髓鞘形成高峰之前、期间和之后的转录组变异性，有助于识别实现髓鞘形成所需的新途径。综上所述，单细胞测序技术是研究神经细胞种类，发育、再生、分化的有力工具。

2.4 免疫学

单细胞测序技术可以帮助我们探索生理和病理状态下免疫细胞状态和分化轨迹。Stewart等[36]使用单细胞测序描绘了人类肾脏的时空免疫拓扑结构，揭示了上皮细胞内免疫基因的解剖学定义的表达模式，在胎儿和成熟的肾脏中，组织内存在的髓样和淋巴样免疫细胞网络都是明显的，并且在出生后，上皮免疫协同抗菌巨噬细胞和中性粒细胞定位于肾脏最易感染的区域，转录程序的获得促进了感染防御能力，进一步完善了人类肾脏的免疫系统是如何分区以应对免疫挑战的概览。Reyes等[37]发现了败血症患者的免疫细胞类型的转录状态变化，利用单细胞RNA测序来分析脓毒症患者的外周血单个核细胞（PBMCs，106 545个细胞）和树突状细胞（19 806个细胞），并根据它们的基因表达谱聚类，定义了16种免疫细胞状态，发现了一种独特的CD14单核细胞状态，这种状态在脓毒症患者中得到了扩展，确定了一组用于分离和定量单核细胞状态的表面标记，并对其表观基因组和功能表型进行了表征，并提出了一个从人类骨髓诱导单核细胞状态的模型。这项研究证明了单细胞基因组学在发现疾病相关的细胞学特征方面的实用价值，并为深入了解细菌败血症免疫失调的细胞基础提供了思路。

以上列举了单细胞测序应用最广泛的几个领域，近年来，随着技术的不断发展不仅促进医学领域的发展，也广泛用于微生物学、农林牧渔等，大大推进了生命科学的发展进程。作为“在单个细胞水平上对基因组进行测序”的单细胞测序技术能够解决传统测序的下列难题：1）能得到每个细胞所独有的特质; 2）可以研究难以在实验室培养扩大，样品量又不能满足全基因组测序分析的要求的样本，例如肿瘤循环细胞、组织微阵列、早期发育的胚胎细胞等; 3）能检测到微量的基因表达了罕见非编码RNA[38]。其独特的优势开启了生命科学探索的新天地。

3 单细胞测序在中医药研究中的应用

结合现代医学的科研思路，利用单细胞测序技术的优势可以从单个细胞水平阐明中医学方药、针灸等的作用机制的难题，为中医药研究提供新的探索思路。

3.1 单细胞测序在中医复方作用机制的应用

中医临床治疗疾病，以中药复方为主要手段。实践证明，大多数疾病的疗效，是通过大量中药有效成分来发挥作用的，因此不能通过传统的单靶标药物筛选来研究中药有效成分，而应从多靶点的研究策略出发。长期以来，由于中药复方成分过于复杂，为其机制研究带来很大难度。中药复方的作用是对人体整体的证候状况而采用的整体调节，实质上也最终对基因组的整体作用[39]。利用单细胞测序技术可以解决一些复方机制研究的限制。如Liang Q等[40]证明左归丸可改变能量代谢基因的表达，防止高糖小鼠胚胎细胞死亡。他们发现左归丸对成人及其后代的糖耐量受损（IGT）都有益处，但是其作用机制尚不明确。把所有受精卵随机分为3组：对照组、模型组和药物组。每组9个受精卵。各组受精卵的培养培养基为：对照组采用细胞培养基，模型组采用补充高糖15.6 mmol/L的细胞培养基，药物组采用与模型组相似但添加了含0.01% v/v左归丸的大鼠血清的培养基，体外培养五天后（2-细胞期胚胎），采用显微操作技术单细胞分离，进行单细胞RNA转录组测序。用DESeq2进行差异基因表达分析，结果，高糖可以下调核糖体通路的基因，而左归丸可以逆转这种下调，从而防止高糖引起的胚胎细胞死亡。此外，高糖可影响糖代谢，影响线粒体功能，而左归丸主要通过三羧酸循环上调呼吸链基因和氧化磷酸化促进糖代谢从而对葡萄糖负荷引起的胚胎细胞死亡有保护作用。单细胞RNA测序技术不仅揭示了高糖影响2-细胞期胚胎的基因调控变化，而且为深入了解左归丸在糖耐量受损模型上的潜在分子机制提供了思路。

3.2 单细胞测序应用于中药作用机制的研究

几千年的中医药学有其独特的优势，但受到有效成分及作用机制不明确等因素影响而不能被西医体系所普遍接受。因此，在中药研究方面，筛选治疗疾病的有效药物并探讨其作用机制历来是其重要内容。目前，由于出现了系统的多靶点药物设计策略，全球对传统草药的兴趣有所增加。中药成分、相应的蛋白靶点、靶点参与的生物过程、药物靶点相互作用和靶点-靶点相互作用是了解中药分子机制的必要条件。

单细胞测序完善了各类相关数据库。由于基于网络的多靶点药物设计方法可以整合不同平台上的相关信息，因此，它们将更有助对比分析出中药治疗疾病的作用机制。Sun Y等[41]以阿尔茨海默病（AD）中草药研究为例，通过对临床试验抗AD中草药的研究，论证了基于网络的中医不同数据源整合的价值，提示雪莲可能主要通过改善症状的方式产生抗阿尔兹海默作用，而丹参的作用靶点主要参与炎性反应和癌相关通路，银杏在这些的基本途径中靶点分布更为多样化，表明其抗阿尔兹海默作用更为广泛。

单细胞测序在中药物种鉴定、种质资源开发和系统发育关系等方面的研究也具有独特的优势，如：Ai H L等[42]利用单细胞测序和基因组装算法[43]的出常见中药射干的完整的质体基因组。瓜蒌，是治疗各种疾病的基本中药。Yang等[44]研究已经确定了该菌叶绿体基因组的完整序列。总基因组长度为157 481 bp，包含一对26 268 bp的反向重复序列（IRs），分别被大单拷贝（LSC）和小单拷贝（SSC）分离，分别为86 478 bp和18 467 bp。共预测130个基因，其中蛋白编码基因85个，rRNA基因8个，tRNA基因37个。进一步的系统发育分析证实了天牛属葫芦科。其完整的叶绿体基因组将在植物系统发育和种群遗传研究的分子标记开发中发挥重要作用。基于网络的各种数据库和组学数据的整合，這不仅有助于对疾病发病机制的整体理解，而且为今后中药在药物发现中的应用提供了新的线索。

4 小结

单细胞测序技术是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序的新技术，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态。单细胞测序技术在中医药研究中的应用是一个特别值得探索的领域，对细胞的异质性的研究能够解决中医药科研上的某些难题。目前中医药领域已经有利用单细胞测序技术对中药、方剂的作用机制的探索。将技术方法与传统中医药研究有机结合，在中医药基础和临床研究的思路与方法上有所创新，随着技术的进步和成熟，将会对中医药研究带来重大突破。利用现代的新技术为传统的中医学抽象的理论寻找物质基础，可大大加快中医学被现代医学和全世界接受的进程。

5 讨论

目前，单细胞测序在中医药领域的应用还非常少，但是却有巨大的发展潜力，我们可以从其他领域的研究成果中获得灵感，探索中医药未知的领域。例如：

5.1 中医诊断学

中医诊断学是根据中医学的理论，研究诊察病情、判断病种、辨别证候的基础理论、基本知识和基本技能的一门学科，中医辨证论治是中医诊断学重要的组成部分，但是辨证论治原理需要用现代科学技术来证明其科学性。以中医辨证治疗骨关节炎为例：骨关节炎在中医属“痹症”范畴，中医将骨性关节炎辨证分为四型，分别是：风寒湿痹、气血瘀阻、湿热痹阻和肝肾亏虚。可以利用单细胞测序来探究不同证型的分子生物学依据。参考Quanbo等[45]对骨关节炎（OA）患者的软骨细胞进行单细胞全转录组测序、分析，使用严重程度指数和对应分析研究了OA景观的转录计划与临床结果之间的关系，得出了关于临床结果的预测指标，明确了不同细胞类型在OA早期诊断和治疗中的作用，病变的滑膜组织相对于正常滑膜组织之间，以及不同疾病的滑膜组织之间，其组成的细胞群类型是有区别的，可以通过对不同时期的不同的细胞类型进行测序分析，得到不同时期滑膜中具有特异性基因表达的不同细胞群，从而对疾病进行分期，了解疾病不同时期的差异性表达的结果。如果将其应用于一个大的患者群体中，单细胞测序还可以揭示功能性病理标记，从而区分疾病不同的临床轨迹和治疗反应[46-47]。同样，我们将单细胞测序用于中医辨证分型的研究，不仅能阐释其科学性，还能使其更加规范化与标准化。

5.2 方药、针灸等治疗疾病的机制研究

中医内服的汤剂、外治针灸疗法对各个系统的疾病均有明显的临床疗效，但是由于其作用机制与靶点尚不明确，加上治疗手段没有标准化，这些问题成为中医走向世界的阻碍。现代科学技术单细胞测序技术与中医相结合，进一步促进中医药机制研究，以肿瘤防治为例：从中药中提取分离得到的抗肿瘤成分，包括三尖杉碱、紫杉醇、羟基喜树碱和长春碱类等，已经成为疗效明确的抗肿瘤药物[48]。参考Guo等[49]对来自14个药物治疗前非小细胞肺癌患者的外周血、癌旁组织和癌组织中T细胞进行了单细胞转录组测序，描绘了已知的免疫治疗靶点基因在不同T细胞亚群中的表达分布，揭示了不同的免疫治疗药物可能靶向的细胞类群。中医药治疗手段的靶点和机制等研究，可以利用单细胞测序来实现。

单细胞测序技术用于中医药研究仍然存在一定的局限，该技术操作复杂而且成本较高，高扩增偏倚、低准确度。目前阶段能够检测的细胞数量受到一定限制，因此难以避免不同样本、个体以及不同研究间存在数据偏差。希望随着技术的优化，标准的统一以及样本量的增加，这种偏差逐渐减小。随着测序技术的不断发展，单细胞测序技术必然会更加高效、高保真、低成本。单细胞测序技术为中医药研究领域揭开新的篇章，我们相信随着单细胞测序技术的不断优化，多组学研究的结合以及时空层面的多维应用，为中医机制的探索提供了有力的支持。如果我们有计算工具可以整合基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、微生物组学、药物基因组学和临床样本的相关信息，这些数据将更有助于在分子网络的背景下理解中医的整体、互补和协同本质，将大大加快中医药走向世界的进程。

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（2020-05-10收稿责任编辑：徐颖）

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