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标题 银杏叶提取物注射液对七氟醚麻醉后大鼠认知功能的影响
范文

    刘海英 杨进国 曾文强 顾欣 朱辉

    

    

    

    摘要? 目的:觀察银杏叶提取物对七氟醚致认知功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:将45只SD大鼠随机分为空白组、七氟醚组及干预组,每组15只。其中空白组不做任何干预措施,七氟醚组吸入七氟醚;干预组同样予吸入七氟醚后腹腔注射银杏叶提取物,用水迷宫比较各组大鼠学习记忆能力的变化,HE染色观察海马病理结构改变,免疫印迹法检测海马组织PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax表达水平的变化。结果:七氟醚组及干预组大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期较空白组延长,差异有统计学意义( P <0.05),其中干预组明显较七氟醚组改善,差异有统计学意义( P <0.05)。空白组大鼠海马组织结构形态正常,七氟醚组及干预组大鼠海马组织均出现明显结构破坏,细胞排列错乱,神经元细胞出现明显变形缩小,其中干预组海马形态结构较七氟醚组改善。经过银杏叶提取物干预后大鼠海马组织PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表达增加,抑制Bax的表达。结论:银杏叶提取物可明显提升七氟醚所致认知能力,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

    关键词? 七氟醚;大鼠;认知;学习记忆能力;银杏叶提取物注射液;海马;机制;PI3K/Akt信号通路

    Effects of Ginkgo Biloba Extract Injection on the Cognitive Function of Rats after Sevoflurane Anesthesia

    LIU Haiying1,YANG Jinguo1,ZENG Wenqiang1,GU Xin2,ZHU Hui1

    (1 Department of Anesthesiology,National Medicine Dongfeng General Hospital,Shiyan 442000,China; 2 Department of Cardiothoracic Surgery,the People′s Hospital of Shiyan 442000,China)

    Abstract Objective: To observe the effects of Ginkgo Biloba extract on cognitive function induced by sevoflurane and explore its possible mechanism. Methods: A total of 45 SD rats were randomly divided into a blank group ( n =15),a sevoflurane group ( n =15) and an intervention group ( n =15).Among them,the blank group did not take any interventions,the sevoflurane group inhaled sevoflurane,and the intervention group also received intraperitoneal injection of Ginkgo Biloba extract after inhaling sevoflurane.The changes of learning and memory ability of rats in each group were compared by water maze,and the pathological changes of hippocampus were observed by HE staining,Western blotting was used to detect the expression levels of PI3K,Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax in hippocampus. Results: 1) The swimming trajectory and escape latency period of rats in the sevoflurane group and the intervention group were longer than those in the blank group ( P <0.05),and those in the intervention group were significantly better than those in the sevoflurane group ( P <0.05).2) HE staining showed that the hippocampal structure of rats in the blank group was normal,and the hippocampal tissue of rats in the sevoflurane group and the intervention group showed obvious structural destruction,disordered arrangement of cells and obvious deformation and shrinkage of neurons.The morphological structure of the hippocampus in the intervention group was better than that in the sevoflurane group.3) Western blotting showed that after the intervention of Ginkgo Biloba extract,the phosphorylation of PI3K and Akt and the expression of Bcl-2 in hippocampus were increased,and the concentration of Bax was inhibited. Conclusion: Ginkgo Biloba extract can significantly improve the cognitive function induced by sevoflurane,and its mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt signal pathway.

    Keywords? Sevoflurane; Rat; Cognition; Learning and memory ability; Ginkgo Biloba extract injection; Hippocampus; Mechanism; PI3K/Akt signal pathway

    中图分类号:R283 文献标识码:A? doi: 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.009

    七氟醚以血气分配系数低、麻醉诱导速度快、麻醉深度易于控制、苏醒快速等特点被广泛应用于临床,但随着研究的不断深入有文献[1]揭示七氟醚可导致一过性认知障碍,其作用机制与PI3K/AKT信号通路有关,PI3K/AKT信号通路是经典的抗凋亡通路,故我们认为激活PI3K/AKT信号通路是改善术后认知障碍的途径。银杏叶提取物属于中药制剂,目前研究揭示其有利于脑损伤与记忆等功能的恢复,但作用机制尚不明了。银杏叶提取物改善认知是否通过PI3K/AKT信号通路进行介导?由此我们进行动物模型研究,以期探讨银杏叶提取物改善七氟醚引起认知障碍的可能机制。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验动物

    选取45只SPF级SD雄性大鼠,购自湖北省动物研究中心(动物生产许可证号:SCXK(鄂)2016-0016),体质量220~250 g,平均体质量(230±10.5)g;鼠龄3~5个月,平均鼠龄(3.5±1.1)个月。

    1.1.2 药物

    七氟醚(购自山东鲁南贝特制药有限公司,批号:65170507);银杏叶提取物(北京双鹤药业有限公司,批号:H20169283)

    1.1.3 试剂与仪器

    Morris水迷宫供应商来自中国科学院药物研究所;PI3K(货号:173665)、Akt(货号:4691s)、p-Akt(货号:4060s)、Bax(货号:5023T)、Bcl-2一抗抗体(货号:15071s),以上均购自美国CST公司;生物双筒显微镜(上海精密仪器仪表有限公司,型号:BM-1000);Vamos气体检测仪(宁波市高品科技有限公司,型号NGP40-M400)。银杏叶提取物注射液(金纳多,中豪国际有限公司,批号:100270178)5 mL/支。

    1.2 方法

    1.2.1 分组与模型制备

    将45只大鼠按随机数字表法分为3组,分别是空白组、七氟醚组及干预组,每组15只。3组大鼠在鼠龄、体质量、饲养环境等方面差异无统计学意义( P >0.05)。具有可比性。模型制备(麻醉):将七氟醚组及干预组置于自制麻醉箱(大小70 cm×40 cm×20 cm)中,将麻醉机接入麻醉箱,随后麻醉机释放七氟醚,同时使用Vamos气体检测仪对麻醉箱内七氟醚浓度进行检测,使其保持浓度2.0%,持续吸入30 min,随后用1.5%七氟醚麻醉维持4 h。

    1.2.2 干预方法

    完成1.2.1步骤后将七氟醚组大鼠放回饲养笼内,干预组腹腔注射银杏叶提取物,1次/d,0.4 mL/kg。连续干预14 d。

    1.3 检测指标与方法

    1.3.1 Morris水迷宫测试

    将水迷宫设置为4个象限,分别是第一象限、第二象限、第三象限及第四象限。每个象限均设置特殊标记以便于实验鼠记忆位置信息。本研究将平台置于第一象限,并将水迷宫内注入清水直至没过平台,并在计算机软件中标记平台位置,随后将大鼠分别从一、二、三、四个象限的顺序放入水中,记录大鼠寻找到平台的时间,设置为逃避潜伏期,同时记录大鼠寻找到平台的总路程。造模前对所有大鼠进行适应性训练2 d,4次/d。

    1.3.2 HE染色观察海马病理结构改变

    从各组中随机抓取3只大鼠,充分麻醉后取出脑组织,冰上分离出海马组织,浸泡于4%多聚甲醛溶液,随后后进行脱水,浸蜡,包埋,将蜡块制作成每片5 μm的组织薄片,再根据说明书进行HE染色,具体步骤如下:二甲苯20 min→100%乙醇10 min→95%乙醇,5 min→80%乙醇5 min→蒸馏水5 min→苏木精染色15 min→流水冲洗15 s→返蓝20 min→伊红染色5 s→流水冲洗15 s→80%乙醇5 min→95%乙醇5 min→100%乙醇Ⅱ5 min→100%乙醇Ⅰ5 min→二甲苯5 min→中性树胶封片。随后将玻片置于光学显微镜下观察并拍照。

    1.3.3 免疫印迹法检测海马组织PI3K、Akt、p-Akt、Bax表达水平的变化

    从各组中随机抓取3只大鼠,充分麻醉后取出脑组织,按照100 mg∶ 1 mL裂解液的比例加入相应体积的蛋白裂解液,4 ℃下静置5 min,随后将各样本置于5 000 r/min中,离心半径15 cm,离心10 min,随后吸取上清液,并用BCA试剂盒进行总蛋白定量测定,并计算上样量。随后将蛋白样本置于100金属浴锅中加热变性10 min,用事先配置好的电泳胶体进行电泳120 min,并将目的蛋白充分转移至PVDF膜,分别加入PI3K、Akt、p-Akt、Bax及β-actin一抗抗体,用TBST将脱脂奶粉配制成5%浓度,将转印后目的蛋白的PVDF膜进行封闭2 h,随后用PBS冲洗,置于显影仪器中,滴入ECL显影液,反应60 s后进行条带扫描,得出OD值。

    1.4 统计学方法

    采用SPSS 20.0統计软件进行数据分析,3组数据同时符合正态分布和方差齐性则采用单因素方差分析,若其中一组数据不符合正态分布,则采用多组秩和检验,以 P <0.05为差异有统计学意义。

    2 结果

    2.1 各组游泳轨迹和逃避潜伏期变化

    七氟醚组及干预组大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期较空白组延长,差异有统计学意义( P <0.05),其中干预组明显较七氟醚组改善,差异有统计学意义( P <0.05)。见表1及图1。

    2.2 HE染色结果

    HE染色提示空白组大鼠海马组织结构形态正常,七氟醚组及干预组大鼠海马组织均出现明显结构破坏,细胞排列错乱,神经元细胞出现明显变形缩小,其中干预组海马形态结构较七氟醚组改善。见图2。

    2.3 各组海马组织PI3K、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2表 达比较

    七氟醚麻醉后大鼠海马组织PI3K、p-Akt、? Bcl-2水平下降,Bax表达增加,经过银杏叶提取物干预后大鼠海马组织PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表达增加,抑制Bax的浓度。见图3及表2。

    3 讨论

    术后认知障碍(Postoperative Cognitive Dysfunction,POCD)指的是术前无认知方面缺损,受诸多因 素(以麻醉为主)后出现一定程度认知能力下降,包括计算力、记忆力、定向力、执行力等[2-4]。POCD不但严重影响病情恢复,还增加社会医疗负担。POCD影响因素众多,目前对其发病机制尚无统一定论。近年来,研究发现,七氟醚麻醉后极易导致患者出现认知功能障碍,且多数发生于术后1~3 d[5-7]。海马是与认知功能关系密切的大脑组织结构,根据解剖学可知[8-10],海马是大脑记忆回路的重要组分,目前大量关于认知的研究亦集中于海马。在本研究中我们对七氟醚麻醉后大鼠的学习记忆能力进行检测,结果显示接受七氟醚麻醉的大鼠游泳轨迹和逃避潜伏期较空白组延长,这提示在七氟醚麻醉后大鼠的学习记忆能力确受到明显受损,且在HE染色中我们发现七氟醚麻醉后大鼠海馬组织出现明显结构破坏,细胞排列错乱,神经元细胞出现明显变形缩小,这就说明七氟醚对大鼠的海马结构亦产生了不利的影响。

    随着研究的不断深入研究人员发现神经元细胞的异常凋亡与POCD关系密切,其中PI3K/AKT信号通路是经典的抗凋亡通路,目前已有文献[11-12]证实PI3K/AKT信号通路可能是介导POCD的发生发展。PI3K是该通路重要因子,受激活后可促使细胞膜上重要成分肌醇发生磷酸化[13-14],进一步促使PI3K的第二信使因子PIP3生成,随后PIP3于Akt相结合后AKT由此出现核移位后致其构象发生变化,在构象变化后产生磷酸化反应而被激活产生p-Akt[15-16]。Bcl-2与Bax均与细胞凋亡关系密切,当Bcl-2表达占优势时抑制细胞凋亡,反而Bax表达强于Bcl-2时体现促进细胞凋亡[17]。在本研究中我们发现七氟醚麻醉后大鼠海马组织PI3K、p-Akt、Bcl-2水平下降,Bax表达增加,这提示七氟醚麻醉引发POCD确与PI3K/AKT信号通路介导的细胞异常凋亡有关。这与国内外诸多文献结果一致。

    银杏叶的主要成分是银杏黄酮苷及银杏总内酯,有研究显示银杏叶制剂可明显改善机体血脂代谢、血液流变学,是目前迄今为止被认为是改善认知行之有效的药物之一。在本研究中我们利用银杏叶提取物作为干预手段,结果显示银杏叶提取物明显缩短七氟醚麻醉麻醉大鼠的游泳轨迹和逃避潜伏期,且改善了大鼠的海马形态结构,这提示银杏叶提取物确对POCD有明显的脑保护效应,此外我们进一步检测了PI3K/AKT信号通路标志性蛋白的表达情况,结果显示经过银杏叶提取物干预后大鼠海马组织PI3K、Akt磷酸化程度提高以及Bcl-2表达增加,抑制Bax的表达,这提示银杏叶提取物可抑制细胞异常凋亡,从而实现对POCD的脑保护效应。由此七氟醚可对大鼠造成一过性认知障碍,银杏叶提取物可明显提升认知能力,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

    参考文献

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    (2019-04-09收稿 责任编辑:张雄杰)

    基金项目:湖北省教育厅科学技术研究计划优秀中青年人才项目(Q20122404)

    作者简介:刘海英(1980.01—),女,研究生,主治医师,研究方向:临床麻醉疼痛诊疗,E-mail:chengyan198303@163.com

    通信作者:杨进国(1972.12—),男,博士,主任医师,研究方向:麻醉与器官功能保护,E-mail:yrxczy@126.com

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更新时间:2025/3/14 20:24:06