《牛至油及其主要成分的体外抑菌实验》-理学论文，中医中药论文-论文范文参考-科学狗论文网

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牛至油及其主要成分的体外抑菌实验

范文

许璐喻毅曹宇李瑶谢艳华李捷王四旺

摘要? 目的：比較牛至油、香芹酚、百里香酚和对伞花烃对6株标准菌的抑菌效果。方法：采用滤纸片法以及试管二倍稀释法，以头孢曲松钠和氟康唑作为阳性对照，分别采用牛至油、香芹酚、百里香素、对伞花烃对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌进行体外抑菌实验，测定抑菌圈的大小，最小抑菌浓度（MIC）以及最小杀菌浓度（MBC）。评价各试药的抑菌效果。结果：牛至油、香芹酚、百里香酚对不同标准菌株均有明显抑菌效果;滤纸片法显示牛至油、香芹酚、百里香酚对选定的6株菌株皆高度敏感，对伞花烃对其菌株耐药。试管二倍稀释法结果表明，牛至油、香芹酚抑菌效果稍强于百里香酚，但这3种植物挥发油对铜绿假单胞菌的抑菌效果与其他菌株相比较弱。结论：牛至油、香芹酚和百里香酚对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌具有显著体外抑菌作用。

关键词? 牛至油;香芹酚;百里香素;植物精油;试管二倍稀释法;最小抑菌浓度;最小杀菌浓度;抑菌作用

Experimental Study on Antibacterial Activity of Oregano Oil and Its Main Components in Vitro

XU Lu1，YU Yi2，CAO Yu 1，LI Yao3，XIE Yanhua3，LI Jie1，WANG Siwang3

（1 Department of Traditional Chinese Medicine and Natural Pharmacy，School of Pharmacy，Air Force Military Medical University，Xi′an 710032，China; 2 Unit 66295，Songlindian town，Zhuozhou city，Zhuozhou 072761，China; 3 Department of Life Science and Medicine，Northwest University，Xi′an 710069，China）

Abstract Objective： To compare the antibacterial effects of oregano oil，carvacrol，thymol and para-cymene on 6 standard strains. Methods： The filter paper method and the tube double dilution method were used.Ceftriaxone sodium and fluconazole were used as positive controls.Oregano oil，carvacrol，thyme，p-cymene against Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumoniae，Enterococcus faecalis，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida portuguese in vitro antibacterial experiment were used to determine the size of the inhibition zone，the minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC）.The antibacterial effects of each test drug were evaluated. Results： Oregano oil，carvacrol，thymol had antibacterial effects on different standard strains.The filter paper method showed that oregano oil，carvacrol and thymol were highly sensitive to the 6 selected strains.Para-cymene is resistant to these standard strains.The tube double dilution method showed that the antibacterial effects of oregano oil and carvacrol were slightly stronger than thymol，but the antibacterial effects of this 3 essential oils against Pseudomonas aeruginosa were weaker than other strains. Conclusion： Oregano oil，carvacrol and thymol have strong antibacterial activity against the strains of Staphylococcus aureus，Klebsiella pneumoniae，Enterococcus faecalis，Escherichia coli，Pseudomonas aeruginosa，Candida albicans.

Keywords? Oregano oil; Carvacrol; Thymol; Essential Oil; Tube double dilution method; Minimum inhibitory concentrations; Minimum bactericidal concentration; Antibacterial effects

中图分类号：R284 文献标识码：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.010

牛至也被稱为土香薰，土茵陈，原名小叶野薄荷，为唇形科牛至属的多年生草本植物，载于《植物名实图考》，具有解表，理气，化湿，利水的作用[1]。牛至油是从牛至中提取出的淡黄色具有挥发性的液体，主要含有酚类和萜烯类物质如香芹酚，百里香酚等，在国内外研究中对多种细菌、真菌都有较好的抑制作用，而且具有很强的抗氧化活性[1-6]。目前，牛至油被广泛用作作为饲料添加剂，能够促进动物肠道菌落平衡和营养物质的吸收、从而促进动物生长，增强免疫能力[2，7]。牛至精油还可作为天然植物保鲜剂，可以取代化学成分作为食品添加剂，具有非常好的防腐作用，其特有的芳香性也能够作为调味品改善食物风味[3]。然而，牛至油中的抑菌成分尚不清楚，特别其在医药应用方面研究较为鲜见。

我们对牛至油及其主要成分香芹酚、百里香酚、对伞花烃进行了相关体外抑菌实验研究，选取常见的6种致病菌株，旨在探究牛至油及其主要成分抑菌作用和揭示发挥抗菌作用的功效成分，为其进一步研发大健康产品提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器高压蒸汽灭菌锅（日本三洋电机株式会社，型号：MLS-3750）;CO2培养箱（上海力康，型号：HF212）;HDL生物安全柜（北京东联哈尔仪器制造有限公司，型号：HPsafe-1200LC）;微量移液器吉尔森（上海麦尚科学仪器有限公司，型号：PL）;电子比浊仪（法国生物梅里埃，型号：400122E-0032）;赛多利斯分析天平（德国赛多利斯公司，型号：BSA224S-CW）。

1.2 试药牛至油（江西省吉水县俊达天然香料油厂，批号：20180404）;香芹酚（吉水县益康天然香料油提炼厂，批号：20170603）;百里香酚（上海迈坤化工有限公司，批号：20170415）;对伞花烃（广东翁江化学试剂有限公司，批号：20180315）;头孢曲松钠（上海罗氏制药，批号：SH6101）;氟康唑（广东逸舒制药有限公司，国药准字H20066085）;二甲基亚砜（天津市富宇精细化工有限公司，批号：20151109）;普通肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司，批号：20180701）。

1.3 菌种及培养基实验所用菌株见表1所列，所有菌种均由空军军医大学第一附属医院检验科提供。

2 方法与结果

2.1 试药配制阳性药物的配制：头孢曲松钠的配制，精密称取头孢曲松钠粉末5.12 mg，用无菌生理盐水溶解至10 mL，得浓度为512 mg/L的药液。氟康唑的配制：方法同头孢曲松钠配制，得浓度为512 mg/L的药液。

2.2 菌悬液的配制用无菌接种环将以上菌种分别接种于血琼脂培养基上，细菌菌种于37 ℃恒温培养箱中孵育24 h，真菌菌种孵育48 h，再挑取单个菌落用无菌水稀释，麦氏比浊仪测得其浓度达到0.5（细菌总数达到1.5×108 CFU/mL），备用[8-9]。

2.3 营养肉汤的配制称取6 g普通肉汤粉末，加入带塞锥形瓶中，量取200 mL蒸馏水，震荡使其溶解，121 ℃高压灭菌30 min备用。

2.4 滤纸片法（K-B法）测定抑菌圈大小取MH培养基，用一次性棉拭子蘸取经过麦氏比浊仪测定好的菌悬液于培养基表面均匀涂布，再用镊子将6 mm无菌滤纸片贴于培养基表面，轻轻按压贴紧，移液枪吸取25 μL试药缓慢滴在无菌滤纸片上，再将培养基倒置，放入37 ℃培养箱中培养，待细菌培养24 h，真菌培养48 h后观察测量抑菌圈的直径，记录。实验重复3次。药物敏感性判断标准见表2[9]。

2.5 试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）及最小杀菌浓度（MBC）

最小抑菌浓度的测定[10-11]：取无菌试管9只，排成一排并标号，每管加入配置好的灭菌营养肉汤1 mL，第1管中加入1 mL试药，混匀后吸取1 mL加入第2管，第2管混匀后吸取1 mL加入第3管，重复此步骤直到第7管混匀，吸取1 mL弃去，此时各管中试药浓度依次为10、5、2.5、1.25、0.625、0.156 25、0.078 125 mL/L。接下来每管分别加入配置好的菌悬液10 μL，第8管只加入肉汤及菌悬液做无药阳性对照，第9管只加入肉汤及试药做无菌阴性对照。阳性对照组的设置，同样取无菌试管共12只，标号，每管加入1 mL灭菌营养肉汤，第1管加入1 mL配好的已知浓度的阳性药物（细菌采用头孢曲松钠，真菌采用氟康唑），混匀后吸取1 mL加入第2管，重复操作，连续倍比稀释直到第10管，吸取1 mL弃去，此时各试管药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 mg/L。第11管加入肉汤和菌液做无药阳性对照，第12管加入肉汤和阳性药物做无菌阴性对照。最终以阳性对照组浑浊，阴性对照组澄清为标准。观察各个试管内肉汤的澄清度状况，记录肉汤浑浊的前一管的试药浓度为最小抑菌浓度，实验操作重复3次。

最小杀菌浓度的测定：测定最小抑菌浓度后，用10 μL接种环从各个组澄清管中取一环培养物划线接种于血琼脂培养皿中，置于37 ℃培养箱中，细菌培养24 h，真菌培养48 h后，观察培养平板上是否有菌株生长，记录无菌株生长的最小试药的浓度，即为最小杀菌浓度。

2.6 各试药的抑菌效果表3结果显示，牛至油及其主要成分香芹酚，百里香酚对6种待测菌株均有良好抑制作用。滤纸片法观察牛至油、香芹酚、百里香酚对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌均高度敏感，抑菌圈直径≥16 mm。对伞花烃则对此6种菌株均耐药，抑菌圈直径<10 mm。阳性对照组头孢曲松钠对粪肠球菌不敏感，对其他菌株高度敏感。牛至油中有抑菌活性的成分可能是香芹酚及百里香酚。

2.7 不同浓度试药抑菌活性

以最小抑菌浓度及最小杀菌浓度说明各试药的抑菌活性，结果见表4～5。37 ℃培养24～48 h后，肉眼观察试管内液体澄明度，记录实验结果。

3 讨论

牛至油、香芹酚、百里香酚对6种标准菌株均有一定程度的抑制作用，阳性药物组头孢曲松钠以及氟康唑MIC及MBC结果符合参考值说明此次研究有效[10]。牛至油、香芹酚和百里香酚组对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、葡萄牙念珠菌抑菌效果好，MIC为0.312 5 mL/L时可抑制菌株生长，牛至油及百里香酚对肺炎克雷伯菌MIC值为0.625 mL/L，相较之下香芹酚对肺炎克雷伯菌的抑菌效果更好，MIC值为0.312 5 mL/L，牛至油、香芹酚、百里香酚都对铜绿假单胞菌的抑菌效果最弱，MIC值为1.25 mL/L。

牛至油及香芹酚对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌的杀菌效果相当，MBC值为0.625 mL/L，百里香酚对金黄色葡萄球菌的杀菌效果与牛至油及香芹酚相当，对肺炎克雷伯菌及粪肠球菌的作用较弱，MBC值为1.25 mL/L。香芹酚及百里香酚对大肠埃希菌的杀灭作用稍逊于牛至油，此3种试药对葡萄牙念珠菌的杀菌作用最好，MBC值均为0.312 5 mL/L;对铜绿假单胞菌杀菌作用最弱，MBC值分别为1.25、1.25、2.5 mL/L;这种差别可能与其抗菌作用的不同机制有关，具體还需下一步探讨。

牛至油、香芹酚、百里香酚对实验所用的6株标准菌“金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、葡萄牙念珠菌”等均具有明显的抑制作用。滤纸片法结果显示牛至油、香芹酚、百里香酚对选定的菌株均高度敏感，最小抑菌浓度及最小杀菌浓度结果表明牛至油、香芹酚抑菌效果强于百里香酚，由此说明，牛至油中发挥抑菌作用的主要功效成分与香芹酚和百里香酚高度相关，但这3种试药对铜绿假单胞菌的抑菌效果与其他菌株相比更弱。

牛至油、香芹酚、百里香酚对霉菌也有较强的抑制作用[12-13]，但由于条件限制，未能对其抑制霉菌的作用进行实验探讨。

病原微生物引起的食品变质以及人体摄入后导致的食物中毒严重危害着人们的生命健康，是世界范围内的公共卫生问题[14-15]。由于化学防腐添加剂所潜藏的风险，近年越来越多的研究者期待研发天然产物的应用，以消除微生物污染，确保食品安全以及品质[15]。牛至油系天然产品，是从植物中提取的一类小分子挥发性物质，难溶于水，主要成分有醛酮类，酚类及萜类，已经证实其具有抗氧化、抗菌、抗病毒活性，在医药、食品、化妆品行业将具有重要的应用潜质[4，16]，本研究证实其中香芹酚和百里香酚是牛至油中最有效的功效成分，为进一步深入研究奠定了基础。

牛至油是最有效的抗菌天然产物，对人体健康有积极作用，主要成分香芹酚、百里香酚可用来开发防治疾病的产品。近年来在牛至油抗氧化，抗炎、抗糖尿病，抗增殖等多个方面研究已受重视，具有广阔的开发潜力和应用前景。

参考文献

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（2019-03-12收稿责任编辑：张雄杰）

基金项目：陕西省创新药物研究中心（现代中药新药研发）平台建设项目（2015SF2-08-01）;陕西省卫生和计划生育委员会科技创新基地项目（S2018-ZC-GCZXXY-SF-0005）

作者简介：许璐（1996.02—），女，硕士研究生在读，研究方向：中药学，E-mail：13092997710@163.com

通信作者：王四旺（1958.08—），男，硕士，教授，博士研究生导师，研究方向：中药学，E-mail：wangsiw@fmmu.edu.cn

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