《黄芪甲苷改善高糖受损内皮祖细胞生物学功能的实验研究》-理学论文，中医中药论文-论文范文参考-科学狗论文网

标题

黄芪甲苷改善高糖受损内皮祖细胞生物学功能的实验研究

范文

余亦程熊武蔡昫王禹萌肖慧白雪邹晓玲

摘要?目的：研究黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）干预高糖受损人内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）增殖的最佳浓度，并探讨AS-IV对高糖受损EPCs生物学功能的影响。方法：取足月新生儿脐带血分离、培养并鉴定EPCs，将鉴定成功的EPCs用30 mmol/L的葡萄糖预处理120 h后，随机分为实验组（HG+AS-IV组）和对照组（HG组），同时设置正常组（NC组）。用CCK8检测不同浓度AS-IV（0、25、50、100、200、400 mg/L）干预EPCs 24 h后的增殖情况，绘制增殖曲线，初步得出AS-IV干预高糖受损人EPCs增殖的最佳浓度。进而通过CCK-8增殖实验、黏附能力测定试验、细胞划痕试验及Matrigel体外成血管实验检测最佳浓度的AS-IV对高糖受损EPCs增殖、黏附、迁移和成管功能的影响。结果：AS-IV促高糖受损EPCs增殖的最佳浓度为100 mg/L;与对照组比较，100 mg/L AS-IV干预后的高糖受损EPCs增殖能力、黏附细胞数、细胞迁移率、体外成管数均明显增加，差异均有统计学意义（P1<0.05）;同时检测实验组与正常组差异无统计学意义（P2>0.05）。结论：AS-IV可显著改善体外高糖受损的人EPCs的生物学功能，恢复其原有活力并具有介导血管新生的潜能。

关键词?黄芪甲苷;内皮祖细胞;生物学功能;体外实验

Abstract?Objective：To study the optimal concentration of Astragaloside IV（AS-IV）on the proliferation of human endothelial progenitor cells（EPCs）impaired by high glucose，and to explore the biological effects of AS-IV on high glucose impaired EPCs.Methods：Full-term neonatal umbilical cord blood was isolated，cultured，and EPCs were identified.The identified EPCs were pretreated with 30 mmol/L glucose for 120 hours，and were randomly divided into an experimental group（HG+AS-IV group）and a control group（HG Group），while the normal group（NC group）was set.CCK8 was used to detect the proliferation of EPCs at different concentrations of AS-IV（0，25，50，100，200，400 mg/L）after 24 hours，and the proliferation curve was drawn to obtain the preliminary conclusion that AS-IV interfered with the proliferation of EPCs in patients with high glucose damage.Optimal concentration.Furthermore，the effects of the optimal concentration of AS-IV on the proliferation，adhesion，migration，and tube-forming function of high-glucose-damaged EPCs were tested by CCK-8 proliferation assay，adhesion ability test，cell scratch test，and Matrigel in vitro angiogenesis experiment.Results：The optimal concentration of AS-IV to promote the proliferation of high-glucose-damaged EPCs was 100 mg/L; compared with the control group，100 mg/L AS-IV-treated high-glucose-damaged EPCs had the proliferation capacity，the number of adherent cells，and cell migration The rate and the number of tube formation in vitro were significantly increased，and the differences were statistically significant（P1<0.05）.At the same time，there was no significant difference between the experimental group and the normal group（P2>0.05）.Conclusion：AS-IV can significantly improve the biological function of human EPCs with impaired high glucose in vitro，restore their original vitality and have the potential to mediate angiogenesis.

Keywords?Astragaloside IV; Endothelial progenitor cells; Biological function; In vitro experiment

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.21.009

内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）可分化成为成熟内皮细胞（Endothelial Cells，ECs），并具有修复内皮损伤、促进缺血组织血管再生的作用[1]。随着我国人口老龄化及生活方式的变化，近年糖尿病及其相关并发症的发病率逐年升高。糖尿病血管相关性并发症是糖尿病患者致残甚至致死的主要原因，然而如何改善高糖环境下的血管损伤及血管新生障碍，目前已成为研究糖尿病血管病变的热点。有研究显示高糖环境下EPCs数量减少，生物学功能受损，导致其损伤修复及血管新生的功能下降[2]。目前黄芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）被发现可提高体外培养EPCs数量，并改善人外周血EPCs增殖、黏附、迁移以及血管形成等生物学功能[3]。本团队前期研究发现AS-IV可改善正常情况下人EPCs的细胞活性及增殖功能[4]，但尚未对AS-IV干预下高糖受损的EPCs功能进行确切研究。本实验通过检测不同浓度AS-IV干预高糖受损EPCs后的增殖功能，初步得到促高糖受损EPCs增殖作用的最佳AS-IV浓度，并进一步探讨最佳浓度AS-IV对高糖受损EPCs生物学功能的影响，为深入研究AS-IV在改善高糖受损人EPCs介导血管新生的机制及临床应用奠定基础。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?细胞?无菌条件下取湖南中医药大学第一附属医院正常剖宫产胎盘脐带血用于获得脐血内皮祖细胞（均签署知情同意书并獲我院伦理委员会同意）。

1.1.2?药物?黄芪甲苷（上海吉至公司，货号：110781-201813，纯度98%）。

1.1.3?试剂与仪器?人淋巴细胞分离液（天津市灝洋生物制品有限公司，货号：LTS10771）;EGM-2培养基（Lonza公司，美国，货号：cc-3162）;ECGS、胎牛血清（Hyclone公司，美国，货号：SH30406.02）;血管内皮生长因子（货号：100-20）、碱性成纤维细胞生长因子（货号：100-18B）、胰岛素样生长因子（货号：100-11）均购自美国Peprotech公司;纤维连接蛋白（Sigma公司，美国，货号：10838039001）;PBS液（Gibco公司，美国，货号：10010023）;AntiCD31抗体（货号：ab28364）、山羊抗兔IgG（H&L）（货号：ab6717）均来自英国Abcam公司;DAPI溶液（北京中科瑞泰公司，货号：C0065）;多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，货号：P1110）;FITC-UEA-I（货号：FS1109-500UG）、Dil-ac-LDL（货号：FS1088-500UG）均来自上海复申生物科技有限公司;CCK-8试剂盒（同仁化学研究所，日本，货号：CK04）;Matrigel基底膜基质胶（上海前尘公司，货号：354230）;荧光显微镜（北京同舟同德公司，型号：Olympus-BX51）;酶联免疫检测仪（型号：热电MK3酶标仪）、细胞培养箱（型号：3110系列水套CO2培养箱）均购自美国Thermofisher Scientific公司。

1.2?方法

1.2.1?分组与模型制备

1.2.1.1?EPCs的培养?取足月健康新生儿脐带血密度梯度离心分离得到单个核细胞。将单个核细胞以1×105/cm2接种于纤维连接蛋白包被12.5 mL培养瓶中，应用M199培养基在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养3 d;取贴壁细胞，半量换培养液，每2～3 d全量换液1次。继续培养7 d;取贴壁细胞，胰酶消化细胞按1∶3进行传代。

1.2.1.2?EPCs的鉴定?CD31抗体联合DAPI核染鉴定[5]：取生长状态良好的P3代细胞，4%多聚甲醛固定30 min;0.1MPBS洗3次×2 min，PBS浸洗后滴加山羊血清，室温封闭30 min;加入Anti-CD31抗体并放入湿盒，4 ℃孵育过夜。PBST浸洗后滴加山羊抗兔IgG（H&L）抗体，20～37 ℃湿盒孵育1 h;加入DAPI染核5 min;0.1 MPBS洗3次×2 min。50%甘油封片，显微镜下观察荧光染色。FITC-UEA-I和Dil-ac-LDL双荧光染色鉴定[6]：将P3代细胞接种于盖玻片上使细胞爬片，加入Dil-ac-LDL（2.4 g/L）并于37 ℃避光孵育1 h，使用多聚甲醛（20 g/L）固定10 min，PBS浸洗后加入FITC-UEA-I（10 g/L）并于37 ℃避光孵育1 h，PBST冲洗，显微镜下观察荧光染色。

1.2.1.3?实验分组?将鉴定成功的人EPCs随分为3等份，分别为正常组（NC组），实验组（黄芪甲苷干预高糖培养组，HG+AS-IV组），对照组（高糖培养组，HG组）。

1.2.2?干预方法?正常组EPCs用无糖的EGM-2培养基预培养120 h;实验组及对照组EPCs在高糖条件为葡萄糖浓度30 mmol/L的EGM-2培养基中预培养120 h;实验组用黄芪甲苷进行干预，正常培养组及对照组用等容量的PBS液处理。

1.2.3?检测指标与方法

1.2.3.1?检测不同浓度AS-IV干预高糖受损EPCs的增殖曲线?取高糖培养（葡萄糖浓度30 mmol/L）对数生长期EPCs，胰酶消化，终止后离心收集，调整细胞悬液浓度（1×105/孔）于96孔板。置于温箱（37 ℃、5% CO2）培养24 h使细胞贴壁。取处于指数生长期的细胞接种到96孔板上，进行CCK8检测。在96孔板中配制100 μL的细胞悬液。培养箱（37 ℃，5% CO2）预培养24 h。向培养板加入0、25、50、100、200、400 mg/L AS-IV作用于EPCs。培养24 h后向每孔加入10 μL CCK8溶液。将培养板在培养箱内孵育4 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

1.2.3.2?黄芪甲苷对高糖下EPCs生物学功能影响的研究?1）EPCs CCK8增殖检测：取对数期EPCs，胰酶消化，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，1×105/孔。置于37 ℃、5% CO2温箱培养24 h，使细胞贴壁。取处于指数生长期的细胞接种到96孔板上。板中配制100 μL的细胞悬液。在37 ℃，5% CO2的条件下预培养24 h。实验组加入100 mg/L AS-IV进行联合培养，NC组及HG组加等量PBS液;3组细胞在培养箱孵育培养48 h。每孔加入10 μL CCK8溶液。在培养箱内孵育4 h。酶标仪测定吸光度。避光保存在室温条件下，设置对照孔，每组设3复孔。2）EPCs黏附能力检测：用胰酶消化贴壁EPCs使细胞脱落，形成500 μL的细胞悬液并计数，然后将EPCs均匀分于24孔板并于37 ℃、5% CO2孵育培养1 h，实验组用100 mg/L AS-IV进行干预，NC组及HG组加等量PBS液;培养8 h后，将EPCs均匀接种在包被有大鼠纤维连接蛋白培养板并培养30 min，2个随机200倍视野计数EPCs。3）EPCs迁移能力检测：先用marker笔在6孔板背后每隔1 cm划横线一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。取对数生长期的EPCs，在孔中加入约5×105个细胞，预培养1 d后用无菌200 μL枪头在培养孔底部中央划一道痕迹，用用PBS洗去划下的细胞。实验组用含有100 mg/L AS-IV的无血清M199完全培养基，NC组及HG组用含等量PBS液的无血清M199完全培养基;在37 ℃，5% CO2培养箱中培养。选择2个不同视野，分别测量0、24 h的划痕创面愈合情况并拍照。细胞迁移能力用迁移率表示，细胞迁移率=（0 h划痕的平均边距-24 h划痕的平均边距）/0 h划痕的平均边距×100%。4）EPCs成管实验：Matrigel基质胶稀释混匀后，以50 μL/孔加入提前预冷的12孔板。37 ℃孵箱放置30 min，当EPCs细胞长到80%～90%时，胰酶消化，用含10%FBS

的DMEM重悬，调整细胞密度至1×105，每孔加入1 mL重悬液。待细胞贴壁后，实验组用100 mg/LAS-IV进行干预，NC组及HG组加等量PBS液;培养24 h后，倒置显微镜下观察并拍照。计算小管长度，并取平均值。

1.3?统计学方法?采用SPSS 21.0统计软件对实验数据中的计量资料进行检验，本资料为完全随机设计单变量计量资料的单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。采用均数±标准差（±s）表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

2?结果

2.1?AS-IV最佳作用浓度?通过不同浓度梯度AS-IV干预高糖受损的EPCs增殖24 h后的细胞OD值，并绘制成增殖曲线，初步得到AS-IV干预高糖受损EPCs最佳浓度为100 mg/L。见图1。

2.2?EPCs的培养及鉴定?第7天培养细胞呈现典型集落形态，中央细胞呈圆形，周边细胞呈梭形。继续培养至10 d，细胞形态以扁平的“铺路石”样为主。见图2。对人内皮祖细胞进行鉴定。细胞膜结合CD31免疫荧光抗体呈绿色，细胞摄取DAPI后核染呈蓝色，融合图像显示膜染绿色荧光，核染蓝色荧光。见图3。同时细胞结合FITC-UEA-I呈绿色，细胞摄取Dil-ac-LDL呈红色，二者双染呈橙黄色改变的细胞即为正常分化的EPCs。见图3～4。

2.3?黄芪甲苷对高糖受损下EPCs生物学功能影

响的研究?在AS-IV（100 mg/L）干预下的实验组与对照组比较，细胞增殖的OD值增大，细胞黏附数增多，细胞迁移相对宽度降低（细胞迁移率升高），体外成管数增多，且差異均有统计学意义（P1<0.05）。实验组与正常组比较，细胞增殖的OD值、细胞黏附数、细胞迁移相对宽度、体外成管数差异无统计学意义（P2>0.05）。见表1，图5～8。

3?讨论

发挥血管新生及形成作用的细胞主要有2个来源，一是源于已分化完全的内皮细胞（ECs）的增殖和迁移，该过程被称为血管生成;另一个则源于骨髓中EPCs动员至外周循坏中，进而归巢到损伤部位并参与初期内皮的形成，这一过程被称为血管形成。EPCs在人体出生后损伤血管修复和血管新生中发挥重要作用，尤其在缺血性病变的组织修复中，需要重建血运，离不开EPCs从骨髓中动员、迁移到病损部位发挥血管新生作用。Kang H等[7]发现在高糖环境下的EPCs的生物学功能受损，并发现糖尿病患者循环系统中的EPCs数目减少、生物学功能减退。Fadini等[8]研究表明糖耐量受损患者的外周循环中的EPCs数量已经开始减少，并发现EPCs的数量、生物学功能及促克隆形成能力的下降是导致2型糖尿病患者外周动脉疾病的重要因素之一。高糖环境下EPCs受损将直接影响损伤血管修复和血管新生，研究发现糖尿病患者来源的EPCs的管状形成能力明显下降，并在实验中发现条件培养基中的VEGF、SDF-1a、PIGF等促血管新生因子被下调，这可能是导致糖尿病患者血管修复及新成障碍的重要原因[9]。

黄芪用于临床已有两千多年历史，《本草纲目》记载黄芪可“排脓止痛、活血生血、内托阴疽、为疮家圣药”。黄芪内的天然活性成分中以黄芪皂苷Ⅳ（别称黄芪甲苷，AS-Ⅳ）最为重要。研究表明，高糖环境下产生的氧化应激在内皮祖细胞损伤中起着至关重要的作用，且活性氧化物质可能是糖尿病状态下导致内皮祖细胞功能障碍的重要因素[3]。AS-Ⅳ具有明的抗显氧化作用，研究发现内皮细胞氧化应激损伤时，黄芪甲苷在能起到保护内皮细胞免受氧化应激损伤并修复内皮细胞的作用[10]。另一方面，研究发现AS-IV可改善人外周血EPCs增殖、黏附、迁移和体外血管生成等生物学功能[11]。当机体处于炎性反应、创伤、缺氧等应激状态时，EPCs会随着SDF-1等趋化因子梯度自骨髓迁移至外周循环中，进而归巢到损伤发挥其作用。国内学者杨雷等[12]发现AS-IV可以显著提升大鼠骨髓源性EPCs的生物学功能，减少EPCs的凋亡，并上调EPCs中SDF-1α和CXCR4的mRNA蛋白及p-CXCR4蛋白的水平。可见AS-IV可干预EPCs发挥血管新生的作用。

目前国内外对黄芪甲苷联合内皮祖细胞促血管新生的研究主要是AS-IV干预正常EPCs而展开的研究，尚未对AS-IV干预高糖受损EPCs发挥血管新生作用进行相关研究。本团队前期研究发现AS-IV能增强正常情况下人脐带血EPCs活性并促进EPCs增殖，且进一步研究发现AS-IV能改善体外人EPCs增殖、黏附、迁移和成管功能生物学功能[4]。本研究是在前期研究基础上，通过检测不同浓度梯度的AS-IV对高糖受损人EPCs增殖的影响，发现100 mg/L的AS-IV干预下，高糖受损人EPCs增殖作用最明显。且进一步研究发现AS-IV能显著改善受损高糖受损人EPCs的增殖、黏附、迁移和成管等生物学功能，这与国内学者陈军等[13]通过不同浓度AS-IV（2、10、50 μg/mL）干预由3，4苯并芘导致的损伤人EPCs后，其增殖、黏附及迁移能力增强的实验研究结果相吻合，但该研究的AS-IV浓度梯度范围较小，并未发现AS-IV发挥作用的最佳浓度;且未对EPCs成管功能进行检测，实验存在欠缺。本研究结果发现100 mg/L AS-IV能显著改善高糖受损EPCs的生物学功能，为深入探讨黄芪甲苷通过高糖受损后的EPCs介导的促进血管新生的作用机制奠定了坚实的基础，为进一步开发以黄芪甲苷为主要成分的促糖尿病皮肤溃疡血管新生的药物制剂提供了实验依据。

参考文献

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[11]陳声荣，吕作陪，甘艳艳.黄芪甲苷对内皮祖细胞生物学功能影响的实验研究[J].江苏中医药，2014，46（3）：76-77.

[12]杨雷，刘萍，刘暖，等.黄芪甲苷对EPCs中SDF-1α/CXCR4的调控作用[J].中国病理生理杂志，2019，35（9）：1587-1593.

[13]陈军，夏武杰，薛杨静，等.黄芪甲苷对3，4苯并芘介导内皮祖细胞损伤的保护作用及机制[J].浙江医学，2016，38（4）：2.

（2020-02-19收稿?责任编辑：王明）

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