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标题

LncRNA　CCAT2/miR-145/p70S6K1分子轴调控口腔鳞癌细胞侵袭转移

范文

陆伟　王永武　淦岷　段青云

[摘要] 目的研究長链非编码RNA CCAT2（CCAT2）、microRNA-145（miR-145）和p70S6K1在口腔鳞细胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）组织中的表达水平，并探讨CCAT2/miR-145/p70S6K1分子轴对OSCC细胞侵袭迁移的影响。方法收集2018年1月～2019年6月在我院进行手术治疗的52对OSCC组织和癌旁正常组织，通过实时荧光定量PCR检测CCAT2、miR-145和p70S6K1的相对表达水平。敲低OSCC细胞中CCAT2和p70S6K1的表达，并通过Transwell实验检测OSCC细胞侵袭迁移的改变。结果 CCAT2和p70S6K1在OSCC组织中表达显著高于癌旁正常组织（P<0.05），而miR-145在OSCC组织中表达显著低于癌旁正常组织（P<0.05）。双荧素酶基因报告实验显示，miR-145靶向抑制OSCC细胞中CCAT2和p70S6K1的表达。敲低CCAT2抑制OSCC细胞体外迁移和侵袭，抑制miR-145和促进p70S6K1的表达，而miR-145-inhibitor上调敲低CCAT2的OSCC细胞中p70S6K1的表达。此外，敲低p70S6K1抑制OSCC细胞体外迁移和侵袭。结论 LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1可以调控OSCC细胞侵袭迁移，在OSCC体内转移中发挥作用，是治疗OSCC的潜在靶点。

[关键词] 长链非编码RNA CCAT2;miR-145;p70S6K1;口腔鳞癌

[中图分类号] R739.8 ? ? ? ? ?[文献标识码] A ? ? ? ? ?[文章编号] 1673-9701（2020）30-0053-05

LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1 molecular axis regulates invasion and metastasis of oral squamous cell carcinoma

LU Wei ? WANG Yongwu ? GAN Min ? DUAN Qingyun

Department of Stomatology， Affiliated Hangzhou First People's Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou ?310006， China

[Abstract] Objective To research the expression level of long noncoding RNA CCAT2（CCAT2）， microRNA-145（miR-145） and p70S6K1 in oral squamous cell carcinoma（OSCC）， and investigate the impacts of CCAT2/miR-145/p70S6K1 molecular axis on invasion and migration of OSCC cells. Methods A total of 52 pairs of OSCC tissues and normal tissues adjacent to cancer from January 2018 to June 2019 were collected. The relative expression levels of CCAT2， miR-145 and p70S6K1 were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The expressions of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC cells were knocked down， and the changes of invasion and migration of OSCC cells were detected by Transwell test. Results The expression levels of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC were significantly higher than those in normal tissues adjacent to cancer（P<0.05）， while the expression of miR-145 in OSCC was significantly lower than that in normal tissues adjacent to cancer（P<0.05）. The results of double luciferase gene report showed that miR-145 targeted inhibited the expression levels of CCAT2 and p70S6K1 in OSCC cells. CCAT2 knockdown inhibited invasion and migration of OSCC cells in vitro， inhibited miR-145 and promoted the expression level of p70S6K1. Meanwhile， up-regulation of miR-145-inhibitor knocked down the expression level of p70S6K1 in OSCC cells with CCAT2. In addition， knocking down p70S6K1 inhibited invasion and migration of OSCC cells in vitro. Conclusion The LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1 can regulate the invasion and migration of OSCC cells and play a role in the in vivo metastasis of OSCC， which is a potential target for the treatment of OSCC.

[Key words] Long noncoding RNA CCAT2; miR-145; p70S6K1; Oral squamous cell carcinoma

大部分口腔癌属于鳞状上皮细胞癌，即口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC），约占头颈部恶性肿瘤患者的90%[1]。淋巴结转移是OSCC最主要的临床特点，也是OSCC患者术后复发的主要诱因[2]。长链非编码RNA CCAT2（CCAT2）首次发现在大肠癌组织中，随后被证实在卵巢癌、胃癌、宫颈癌及食道鳞状细胞癌中异常，并且参与调控癌细胞转移[3]。此外，刘英等[4]在OSCC组织中同样发现CCAT2高表达，且与OSCC的发生发展有关，但并未揭示CCAT2在OSCC细胞转移中的作用。以往研究已证实，CCAT2可以抑制癌细胞中miR-145的表达[5]，而p70S6K1是miR-145的靶基因[6-7]。本研究则进一步探讨CCAT2/miR-145/p70S6K1分子轴对OSCC细胞侵袭迁移的影响，为其应用于OSCC治疗提供较精准的实验室依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1月～2019年6月在我院进行手术治疗的52对OSCC组织和癌旁正常组织。所有OSCC患者在收集组织前未进行化疗、放疗或靶向治疗。本研究经医院医学伦理委员会审查批准，所有参与本研究的患者或其家属对本研究内容知情。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和实时荧光定量PCR ?向组织或细胞中加入适量的RNAiso（TARAKA，Japan）以提取RNA。根据GoTaqR qPCR Master Mix试剂盒（promega，USA）说明书制备20 μL RT-qPCR系统，并使用ABI 7500荧光定量PCR仪器进行扩增。以β-actin为内参，用2-△t△t法计算目的基因的相对表达量。见表1。

1.2.2 细胞培养与细胞转染 ?在6孔板中接种1×106 SCC-154细胞;24 h后，按照LipofectamineTM 2000转染试剂盒（ThermoFisher SCIENTIFIC，USA）说明书所示的转染步骤将miR-NC、miR-145-mimic、miR-145-inhibitor或小干扰RNA（si-NC、si-CCAT2-1、si-CCAT2-2、si-p70S6K1-1和si-p70S6K1-2）分别转入SCC-154细胞内。

1.2.3 Transwell细胞迁移与侵袭 ?Transwell小室（Thermo Fisher SCIENTIFIC，USA）被用于评估OSCC细胞增殖和迁移能力。取1×104个转染后的SCC-154细胞接种到24孔Transwell的上室中，加无血清培养基常规培养。24 h后，取出并去除培养基，用PBS洗涤2次，然后加入甲醇固定30 min后干燥。干燥后的膜片经结晶紫染色20 min后，在显微镜下计数下室细胞数目。

1.2.4 双荧光素酶报告基因检测 ?将野生型（WT）或突变型（MUT）的基因序列克隆到pmirGLO质粒上以获得pmirGLO- p70S6K1 WT/MUT和pmirGLO-CCAT2 WT/MUT，然后使用LipofectamineTM 2000轉染试剂将重组质粒与miR-NC、miR-145-inhibitor或miR-145-mimic一起转入SCC-154细胞中。48 h后，根据双荧光素酶报告基因试剂盒（碧云天生物，中国）说明所述步骤检测荧光素酶活性。

1.3 统计学方法

研究数据由Grahpad Prism 5统计学软件进行分析。两组差异比较使用t检验，多组间通过单因素方差分析进行差异比较;Pearson法用于分析两组数据间的相关性，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA CCAT2在OSCC组织和细胞中表达升高

如图1所示，CCAT2在52例OSCC组织中相对表达水平为（2.520±0.123）（t=12.013，P<0.001）（图1A）;在TNM分期为Ⅰ+Ⅱ和Ⅲ+Ⅳ期OSCC组织中相对表达水平分别为（2.147±0.134）和（3.095±0.169）（t=4.433，P<0.001）（图1B）;在淋巴结转移和未转移OSCC组织中的相对表达水平分别为（3.287±0.153）和（2.129±0.124）（t=5.723，P<0.001）（图1C）。此外，CCAT2 NOK细胞中的表达水平显著低于4种口腔鳞癌细胞系，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P<0.001）（图1D）。

2.2 敲低LncRNA CCAT2抑制OSCC细胞迁移和侵袭

如封三图1所示，敲低CCAT2显著抑制了迁移和侵袭的SCC-154细胞数目（P<0.001）。

2.3 LncRNA CCAT2与miR-145靶向结合

生物信息学预测发现，CCAT2与miR-145具有相互结合的基因序列（图2A）。qPCR结果显示，miR-145在52例OSCC组织中相对表达水平是正常组织的（0.489±0.023）倍（t=12.170，P<0.001）（图2B）;且miR-145在4种口腔鳞癌细胞高表达（图2C）。Pearson法分析显示，在52例OSCC组织中，CCAT2的相对表达水平与miR-145相对表达水平呈负相关（r=-0.545，P<0.001）（图2D）;同样，敲低CCAT2将显著提高SCC-154细胞中miR-145的表达水平（t=12.790、12.350，均P<0.001）（图2E）。荧光素基因报告系统显示，在miR-145-mimic降低CCAT WT荧光素酶活性（t=11.563，P<0.001），而不影响CCAT MUT荧光素酶活性（t=0.912，P=0.413）（图2F）。

2.4 LncRNA CCAT2通过miR-145在OSCC细胞中调节p70S6K1表达

生物信息学预测发现，p70S6K1与miR-145具有相互结合的基因序列（图3A）。p70S6K1在52例OSCC组织中相对表达水平是正常组织的（2.295±0.102）（t=12.092，P<0.001）（图3B）;且经Pearson法分析显示，在OSCC组织中，p70S6K1的相对表达水平与miR-145相对表达水平呈负相关（r=-0.511，P<0.001）（图3C）。此外，荧光素酶基因报告系统显示：转入miR-145-mimic降低p70S6K1 WT荧光素酶活性（t=10.071，P<0.001），而不影响p70S6K1 MUT荧光素酶活性（t=1.173，P=0.306）（图3D）。此外，经Pearson法分析显示，在52例OSCC组织中，p70S6K1的相对表达水平与CCAT2相对表达水平呈正相关（r=0.646，P<0.001）（图3E）。敲低CCAT2可以降低p70S6K1的表达水平（t=13.201，P<0.001）;然而，相比较单独转入si-CCAT2，p70S6K1在共同转入si-CCAT2和miR-145-inhibitorc的SCC-154细胞中表达更高（t=11.352，P<0.001）（图3F）。

2.5 敲低p70S6K1抑制OSCC细胞迁移和侵袭

敲低p70S6K1可显著抑制迁移和侵袭的SCC-154细胞数目，经单因素方法分析，差异有统计学意义（P<0.001）。见封三图2。

3 讨论

尽管lncRNA不编码蛋白，但近年研究证实LncRNA可以通过对靶基因的调控而参与调控细胞的生物学行为[8]。近年来，已经发现越来越多的LncRNA与肿瘤的发展密切相关，且研究发现LncRNA可以用作某些肿瘤的启动子[9]。本研究发现，LncRNA CCAT2在OSCC组织中高表达，这与刘英等[4]研究一致。此外，本研究还发现，在OSCC组织中高表达的CCAT2与OSCC患者TNM分期和淋巴结转移状态有关。但刘英等[4]研究卻发现，尽管淋巴结转移OSCC患者CCAT2的表达高于OSCC患者淋巴结未转移患者，但差异不显著，分析可能是由于两份研究纳入病例不足引起。进一步研究发现，敲低CCAT2抑制OSCC细胞在体外的侵袭和迁移能力。这与之前的很多研究结论是一致的，如LI等[10]发现CCAT2通过Wnt途径促进非小细胞肺癌的增殖和转移;WU等[11]研究发现CCAT2通过调节TGF-β信号通路促进乳腺癌的生长和转移。

以往研究已经表明[5]，CCAT2抑制结直肠癌细胞中miR-145的表达。本研究同样发现，miR-145在OSCC细胞中低表达，并且与CCAT2表达呈负相关;体外研究表明，敲低OSCC细胞中CCAT2促进miR-145表达，miR-145同样靶向抑制CCAT2表达。miR-145已经被发现在多种恶性肿瘤组织中低表达，并发挥抑癌基因的作用，如miR-145在膀胱癌中充当肿瘤抑制因子的作用而直接调节FSCN1的表达[12];miR-145在乳腺癌组织中低表达，并与淋巴结转移、肿瘤分期以及肿瘤大小有关[13]。此外，miR-145还被发现抑制肿瘤细胞的侵袭转移，如SACHDEVA M和MO YY在细胞中研究miR-145的功能时发现，miR-145抑制细胞的增殖、侵袭和迁移[14];Al-Haidari等[15]发现，miR-145通过转录后调控人类抗原R的表达而抑制结直肠癌细胞的迁移。结合本研究说明，CCAT2可能通过抑制miR-145的表达而促进OSCC的侵袭迁移。

本研究结果还显示，p70S6K1在OSCC组织中高表达，且与miR-145表达呈负相关，与CCAT2表达呈正相关;体外研究显示，CCAT2通过抑制miR-145的表达而促进OSCC细胞中p70S6K1的表达。p70S6K1蛋白在很多与恶性肿瘤转移有关的信号通路中发挥重要作用，如SIRT7通过DBC1/SIRT1轴激活Akt和p70S6K1而促进甲状腺肿瘤的发生及癌细胞的增殖转移[16];口服芹菜素通过AKT/P70S6K1/MMP-9途径抑制原位卵巢肿瘤模型癌细胞转移[17]。此外，本研究还发现，敲低p70S6K1的表达可抑制OSCC细胞的侵袭和迁移能力。

综上所述，本研究发现，LncRNA CCAT2和p70S6K1在OSCC组织和细胞中高表达，miR-145低表达;而体外细胞实验表明，LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1可以调控OSCC细胞侵袭迁移。因此，LncRNA CCAT2/miR-145/p70S6K1分子轴可以作为治疗OSCC患者的潜在靶点。

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（收稿日期：2020-06-28）

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