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标题 腺苷受体对大鼠丙泊酚复吸行为的影响及作用机制
范文

    董张雷 王欣 李军 王本福 连庆泉 吴彬彬

    

    

    

    [摘要] 目的 通過静脉自身给药方法建立大鼠丙泊酚复吸模型(环境线索诱导),探讨腺苷受体在丙泊酚复吸行为中的作用机制,并探讨其复吸机制。 方法 (1)清洁级雄性SD大鼠24只(14~16周),采用固定比率FR1程序训练大鼠形成稳定的自身给药模型,戒断14 d后重返原来的训练笼进行环境线索诱导的丙泊酚复吸行为测试,测试前15 min分别腹腔注射等量溶剂和腺苷A2AR拮抗剂KW6002(0.3、1.0、3.0 mg/kg),观察其对大鼠丙泊酚复吸行为的影响,并检测大鼠伏隔核内D2R的表达;(2)另取24只大鼠采用FR1程序进行自身给予蔗糖颗粒训练成功后,同样戒断14 d后进行蔗糖复吸行为测试,在测试前15 min同样腹腔注射等量溶剂和KW6002(0.3、1.0、3.0 mg/kg),观察其对大鼠蔗糖复吸行为的影响;(3)准备24只自发活动测试箱,分别放入24只雄性SD大鼠,适应环境1 h后,腹腔注射腺苷A2AR拮抗剂KW6002(0.3、1.0、3.0 mg/kg)和等量溶剂作为对照,15 min后放回箱底,测试并记录大鼠3 h内的自发活动度。 结果 与对照组相比,腺苷A2AR拮抗剂KW6002可以剂量依赖性地增强环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸行为(P<0.01),并增加伏隔核区D2R表达(P<0.01)。与对照组相比,KW6002对大鼠蔗糖觅药行为及自发活动度均无影响(P>0.05)。 结论 腺苷受体参与调节大鼠丙泊酚复吸行为,可能是通过调节伏隔核区多巴胺受体实现。

    [关键词] 丙泊酚;复吸;腺苷;自身给药

    [中图分类号] R964? ? ? ? ? [文献标识码] A? ? ? ? ? [文章编号] 1673-9701(2020)32-0035-05

    [Abstract] Objective By establishing a rat propofol relapse model(induced by environmental cues) through intravenous self-administration, to explore the mechanism of action of adenosine receptors in propofol relapse behavior and its relapse mechanism. Methods (1)24 clean-grade male SD rats(14-16 weeks). The rats were trained to form a stable self-administration model using a fixed ratio FR1 program. After 14 days of withdrawal, they were reintroduced to training-chambers for propofol relapse testing induced by environmental cues. 15 minutes before the test, the same amount of solvent and adenosine A2AR antagonist KW6002(0.3, 1.0, 3.0 mg/kg) were injected into the abdominal cavity respectively, and its effect on propofol relapse behavior of rats was observed, and the expression of D2R in the rat nucleus accumbens was tested; (2)Another 24 rats were successfully trained with self-administration of sucrose pellets by using the FR1 program. After 14 days of withdrawal, they were also given a sucrose relapse behavior test. 15 minutes before the test, the same amount of solvent and KW6002(0.3, 1.0, 3.0 mg/kg) were injected intraperitoneally) to observe its effect on the relapse behavior of sucrose in rats; (3)Prepare 24 spontaneous activity test boxes and put 24 male SD rats into them. After adapting to the environment for 1 hour, intraperitoneally inject adenosine A2AR antagonist KW6002(0.3, 1.0, 3.0 mg/kg) and the same amount of solvent as a control for 15 minutes. Then put it back to the bottom of the box, test and record the rat's spontaneous activity within 3 h. Results Compared with the control group, the adenosine A2AR antagonist KW6002 can enhance the propofol relapse behavior induced by environmental cues in a dose-dependent manner(P<0.01) and increase the expression of D2R in the nucleus accumbens(P<0.01). Compared with the control group, KW6002 had no effect on the sucrose drug-seeking behavior and spontaneous activity of rats(P>0.05). Conclusion Adenosine receptors are involved in the regulation of propofol relapse behavior in rats, which may be achieved by regulating dopamine receptors in the nucleus accumbens.

    [Key words] Propofol; Relapse; Adenosine; Self-administration

    环境线索诱发的药物渴望和复发行为是药物滥用的主要特征之一,是非常有挑战性的临床问题,也是成瘾药物戒断的主要障碍。研究表明,丙泊酚具有成瘾性,且停药后使用者有再次用药的渴求[1-2]。动物实验同样证明,丙泊酚停药后具有复吸特性[3]。但目前丙泊酚的复吸机制仍未明确,深入研究机制对丙泊酚滥用患者的治疗和戒断具有指导意义。伏隔核(NAc)多巴胺系统是中脑边缘系统重要组成部分,参与众多药物成瘾过程。研究发现,腺苷通过腺苷受体可以调控多种神经递质如多巴胺、谷氨酸和GABA等,在药物的成瘾过程中发挥作用[4-5]。故本研究采用静脉自身给药方式,建立大鼠丙泊酚复吸模型(环境线索诱导),腹腔注射腺苷A2AR,并检测伏隔核内D2R的表达,探讨腺苷受体介导丙泊酚复吸行为的生物学机制,现报道如下。

    1 动物与方法

    1.1 实验动物

    72只雄性SD大鼠,周龄14~16周,体重250~280 g。购买于上海斯莱克实验动物中心。分笼饲养于清洁级动物房内,24 h昼夜节律(9am~9pm),每日食物控制在20 g左右,自由进水。环境温度控制在22~24℃,相对湿度为50%~70%。动物许可证号:SYXK(浙)2010-0150。通过温州医科大学伦理委员会批准,实验过程中遵守《关于善待实验动物的指导性意见》原则(国家科技部2006年颁发)。

    1.2 试剂及配置

    KW6002(美国sigma)溶于10%DMSO+90%ddH2O。丙泊酚(意大利阿斯利康公司,批号NK317),大鼠自发反应操作笼(购于宁波生物科技研究所),电子天平(购于德国赛多利斯),Western blot电泳仪(购于Bio-Rad)。

    1.3 大鼠丙泊酚复吸模型建立

    大鼠颈外静脉插管恢复7 d后开始自身给药训练,训练方式如以往研究[2]。用FR1程序,每天训练3 h。大鼠碰触1次有效鼻触得到1次1.7 mg/kg的丙泊酚注射,给药结束后进入30 s不应期:此时大鼠碰触有效鼻触无丙泊酚注射。不应期结束后进入下一个循环,大鼠碰触无效鼻触时无丙泊酚注射,仅记录鼻触反应次数。约14 d建立稳定的自身给药模型,然后进入戒断期。戒断期间大鼠自由饮水,每日控制饮食30 g。戒断期(14 d)结束后,大鼠重新返回原来的训练笼进行复吸行为测试。大鼠丙泊酚复吸训练开始前15 min,分别给予等量溶剂或KW6002,复吸训练期间大鼠碰触有效鼻触1次可获得1次条件性刺激(即有效鼻触探头内小黄灯亮,同时伴随注射泵转动声音),但无丙泊酚注射。有效鼻触次数明显高于无效鼻触次数,表明环境线索诱导的丙泊酚复吸模型建立成功。

    1.4 大鼠蔗糖复吸实验

    将24只准备好的大鼠随机放入实验训练笼内,同样采用FR1程序,每日训练30 min,连续7 d。同样在大鼠蔗糖觅食行为稳定后戒断14 d,在第15天训练开始前15 min,将大鼠随机分为四组(n=6),分别腹腔注射等量溶剂或KW6002(0.1、0.3、1.0 mg/kg),记录KW6002对大鼠自身给予蔗糖复吸行为的影响。

    1.5 Western-blot检测

    大鼠丙泊酚复吸行为测试结束后立即将大鼠处死,将分离出的脑组织放入匀浆器内,加入蛋白酶抑制剂和裂解液,充分捣碎。将匀浆液转移至1.5 mL离心管内,超声破碎,离心机离心。制胶,上样,电泳转膜,Western封闭液室温封闭2 h。加用一抗,4℃摇床过夜,二抗常温孵育2 h。内参物为GAPDH。最后暗室曝光,Image J 2.0软件分析结果。

    1.6 自发活动检测

    分别将24只大鼠随机放入检测箱中,适应环境1 h后,腹腔注射KW6002(0.1、0.3、1.0 mg/kg)或等量对照溶剂,15 min后将大鼠重新放回测试箱,计算机自动测试并记录大鼠3 h内的自发活动度。

    1.7 观察指标

    (1)大鼠丙泊酚戒断14 d后,与自身给药时比较,有效鼻触次数、无效鼻触次数变化,判断复吸模型是否建立,KW6002给药后大鼠有效鼻触、无效鼻触次数变化及NAc区D2R的表达水平。(2)大鼠蔗糖觅药行为戒断14 d后,有效鼻触次数、无效鼻触次数变化,KW6002给药后对有效鼻触、无效鼻触次数的改变。(3)大鼠自发活动度检测:大鼠3 h内的水平活动距离。

    1.8 统计学方法

    采用SPSS26.0统计学软件分析数据,Graphpad 8.0软件作图。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,重复测量数据采用重复测量方差分析,腹腔注射给药后各组大鼠行为学对比及Western blot检测结果采用单因素方差分析(one-way ANOVA),Levene法检验方差齐性,两两比较采用LSD方法,P<0.05为差异有统计学意义。

    2 結果

    2.1 大鼠丙泊酚复吸模型建立

    随着训练时间延长,大鼠的有效鼻触次数逐渐增加,并趋于稳定,而无效鼻触次数一直无增加,且明显低于有效鼻触次数,差异有统计学意义(P<0.01),表明大鼠丙泊酚依赖模型建立。戒断14 d后,与丙泊酚自身给药组相比,复吸组大鼠的丙泊酚有效鼻触次数显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),而无效鼻触次数无明显改变(P>0.05),环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸模型建立。见表1~2。

    2.2 大鼠蔗糖复吸行为模型建立

    大鼠蔗糖行为训练7 d左右,蔗糖颗粒摄入次数保持在100次左右水平,模型成功建立。戒断14 d后,检测大鼠蔗糖复吸行为即有效鼻触次数保持在较高水平。与蔗糖自身给药组相比,大鼠有效鼻触次数和无效鼻触次数比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

    2.3 腹腔注射KW6002对环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸行为的影响

    大鼠复吸行为测试前15 min分别腹腔注射对照溶剂或A2AR拮抗剂KW6002(0.3、1.0、3.0 mg/kg),观察其对大鼠丙泊酚复吸行为的影响。与对照组相比,各组大鼠2 h内的有效鼻触次数明显增加,差异有统计学意义(P<0.01),而无效鼻触次数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

    2.4 Western blot法检测腹腔注射KW6002对NAc内多巴胺D2R表达水平的影响

    大鼠丙泊酚复吸行为测试结束后,立即将其处死,Western blot法检测四组大鼠NAc内D2R蛋白表达的变化。与溶剂组比,腹腔注射KW6002(1.0、3.0 mg/kg)后,NAc内多巴胺D2R蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。见表5、图1。

    2.5 腹腔注射KW6002对环境线索诱导的大鼠自身给予蔗糖复吸行为的影响

    大鼠蔗糖复吸开始前15 min,分别腹腔注射对照溶剂和不同剂量KW6002(0.1、0.3、1.0 mg/kg),与溶剂组比,大鼠蔗糖顆粒摄入数、无效鼻触数、有效鼻触数未见明显改变(P>0.05)。见表6。

    2.6 腹腔注射KW6002对大鼠活动度的影响

    实验前15 min分别腹腔注射给予KW6002(0.1、0.3、1.0 mg/kg)或对照溶剂。观察KW6002给药对大鼠自发活动度的影响。与对照组相比,KW6002不同剂量组对自发活动度没有影响(P>0.05)。见表7。

    3 讨论

    研究发现腹腔注射腺苷A2AR拮抗剂KW6002可增强环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸行为,且明显增加大鼠NAc区多巴胺D2R表达,而同剂量的KW6002对大鼠自发活动度和蔗糖复吸行为无明显影响。因此,推测腺苷受体参与介导大鼠丙泊酚复吸行为。

    腺苷作为一种内源性嘌呤核苷,根据与腺苷的亲和力不同,分为4个不同的亚型,分别是A1、A2A、A2B和A3受体,在睡眠调节、帕金森病治疗、药物成瘾机制等方面发挥重要作用[6]。研究发现,长期使用吗啡增加大鼠对NAc区的腺苷敏感性,其机制可能是通过抑制腺苷重吸收,通过负反馈作用刺激腺苷释放。而且长期使用吗啡引起纹状体内腺苷转运蛋白表达增加[7-8]。大鼠NAc区的腺苷代谢物水平在阿片类药物戒断期间增加[9]。大鼠腹腔或NAc注射腺苷A2AR阻滞剂DMPX抑制海洛因的摄入[10]。阿片类依赖小鼠敲除A2AR后加重戒断症状[11]。本研究通过腹腔注射KW6002证明其参与大鼠丙泊酚复吸行为,且对大鼠蔗糖复吸行为没有影响,说明其具有特异性。

    腺苷主要通过腺苷受体影响脑内神经递质如多巴胺、谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等的释放,在药物成瘾过程中起调节作用。已知伏隔核多巴胺系统在药物成瘾过程中发挥重要作用。而伏隔核主要通过中型棘突GABA能神经元的直接通路和间接通路兴奋多巴胺受体。其中A2AR大量分布在脑部纹状体区域,该区域主要参与情绪、学习的调节。研究表明,腺苷A2AR可与A1R、D2R、CB1R和mGlu5形成共聚体而相互作用[12-13]。其中以A2AR-D2R共聚体与药物成瘾关系最密切。A2AR-D2R在纹状体苍白球间接通路上形成异二聚体,两者在分子、神经化学和行为学水平上相互拮抗[14-15]。激活NAc内D2R可以通过间接降低GABA。而兴奋A2AR可以恢复D2R引起的腹侧苍白球内的GABA下降。同时A2AR活化可以刺激腺苷酸环化酶,进而激活cAMP-PKA信号通路[16];通过激活D2R可以偶联Gi/o蛋白,从而抑制A2AR介导的cAMP-PKA信号通路[17]。同时,激活A2AR可减弱D2R与多巴胺的结合,进而影响神经元的兴奋性和神经递质的释放[18]。前期研究发现,多巴胺受体、GABA系统均参与大鼠丙泊酚的成瘾过程[2,19-20]。本研究结果显示,腹腔注射KW6002大鼠伏隔核区多巴胺D2R表达增加,从而引起大鼠复吸行为增强。这也符合前期研究结果:腹腔注射D2R减弱环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸行为[21]。根据A2AR-D2R之间相互拮抗的原理,推测阻断A2AR可能激活了D2R介导的信号通路。且本研究结果与前人的研究也一致:腹腔或者NAc内注射腺苷A2AR激动剂CGS21680可减弱大鼠药物环境线索诱导的复吸行为[22-23]。

    综上所述,本研究发现腹腔注射KW6002可以增加环境线索诱导的大鼠丙泊酚复吸行为及脑区D2R表达增加,说明腺苷受体参与介导大鼠丙泊酚复吸行为,可能是通过影响伏隔核内多巴胺受体水平起作用。

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    (收稿日期:2020-07-20)

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