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miR-125b在大鼠颈动脉球囊损伤中的表达及其对血管平滑肌增殖和迁移的作用

范文

王孝高　王颖　陈卫国　王孝荣　余朝文　孙勇　唐文波　陈世远　官泽宇　高涌

【摘? 要】目的：分析microRNA-125b （miR-125b）在大鼠颈动脉球囊损伤模型中的表达及其对血管平滑肌细胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）增殖和迁移的作用。方法：建立大鼠颈动脉球囊损伤模型鼠，分离并培养ASMCs。使用腺病毒携带的miR-125b模拟物（mimics）转染ASMCs，使用实时荧光定量多聚酶链反应（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测转染前后ASMCs中miR-125b表达水平。通过Cell Counting Kit-8检测miR-125b对ASMCs增殖的影响;通过Transwell实验及划痕实验检测miR-125b对ASMCs迁移能力的影响。结果：成功建立大鼠颈动脉球囊损伤模型并制备颈动脉ASMCs。转染miR-125b mimics，miR-125b的表达显著上调（P<0.001）。过表达miR-125b后，ASMCs的增殖及迁移能力减弱（P均<0.05）。结论：miR-125b可以抑制ASMCs增殖及迁移。

【关键词】miR-125b;颈动脉球囊损伤模型;血管平滑肌细胞;细胞增殖;细胞迁移

【中图分类号】R54????? 【文献标识码】A????? 【文章编号】1672-3783（2020）09-0050-02

动脉硬化（Atherosclerosis，AS）的发展过程主要有三个时期：动脉内膜脂质斑纹期、纤维斑块形成期以及粥样斑块形成期。粥样斑块形成期的AS常表现为有临床症状的动脉缺血性病变，具体有冠状动脉性心脏病、脑梗死及下肢动脉硬化闭塞症（atherosclerosis obliterans， ASO）等[1]。粥样斑块形成期AS的患者治疗难度大且生活质量差[2-3]。

在动脉硬化的发生发展过程中，动脉血管壁平滑肌细胞（arterial smooth muscle cells，ASMCs）进行的增殖以及平滑肌细胞细胞的迁移都起到十分关键的作用。期研究表明，微小核糖核酸（miR，miR）与ASMCs的增殖和迁移密切相关。如miR-1298下调可以通过靶向连接蛋白间接调控血管平滑肌细胞的增殖及迁移，在新生血管内膜生长和功能中起到的作用[4]。本研究通过探索miR-125b对ASMCs增殖和迁移的作用，以期为治疗AS寻找新思路。

1 资料与方法

1.1 试验试剂及仪器

主要试剂有：Trizol （life technologies）、 M-MLV （promega）、 dNTPs （promega）、Bulge-LoopTM miRNA （广州锐博）、Rnase Inhibitor （promega）、SYBR Master Mixture （TAKARA）、oligod T （上海生工）、DMEM（Gibco）、Transwell试剂盒（Corning）、0.25%胰酶（上海化学试剂公司）、胎牛血清（GIBCO）、胎牛血清 FBS（Ausbian）、结晶紫（生工生物工程股份有限公司）。主要仪器有：Real time PCR仪（MX3000p Agilent公司）、Nanodrop分光光度计（2000/2000C Thermo）、96孔板（Cornning）、生物安全柜（Thermo）、酶标仪（Tecan infinite）、CO2培养箱（SANYO）、荧光显微镜（奥林巴斯）、血球计数板（求精）、离心机（赛默飞世尔科技中国有限公司）、倒置显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）。

1.2获取ASMCs

以Wistar大鼠为研究对象，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（300mg/kg），解剖并游离颈动脉，穿刺颈动脉并将0.014mm 导丝插至膈肌水平，导丝引导下插入直径1mm球囊，以0.10-0.15ml肝素生理盐水充盈球囊，缓慢来回抽动3次血管内膜制备大鼠颈动脉损伤模型。对照组大鼠同等条件下进行麻醉及游离颈动脉，但不经过上述颈动脉损伤处理，同样条件下与实验组Wistar大鼠培养1周。处死并切取颈动脉标本，显微器械分离去除血管内膜及外膜获得动脉中层组织，采用眼科剪刀剪碎动脉中层组织，剪成1mm2左右不规则碎片，再将碎片置于含有20%胎牛血清的M199培养基中，再将组织悬液置于15ml离心管中800转/分室温下离心5分钟，去除上清液，收集动脉中层组织碎片，待组织块略干涸，紧贴瓶底后，加入2ml含20%胎牛血清的M199培养基，静置培养直到增殖达到融合。平滑肌细胞原代培养存在多种形状，常见的有带状、梭状、星状等，传至第3代可获得纯化的动脉平滑肌细胞，应用a-action免疫组化进行平滑肌细胞的鉴定，获取研究的ASMCs。

1.3 qRT-PCR

收集ASMCs，先以2000转/分钟离心5分钟，移除上清液留存细胞沉淀液，将1 mL Trizol加至细胞沉淀液，于室温下摇匀混合液，再静置5分钟，转移至新的1.5 mL EP管中。EP管加入200微升氯仿，倒置后静置10分钟后，再以12800转/分速度离心，再经过一系列处理后，待RNA沉淀基本透明时，加入RNase-free水至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA的浓度及质量。RNA逆转录获得cDNA：每1 nmoL引物加入RNase-free water 200μL，涡旋振荡充分溶解，然后瞬时离心，配成终浓度为5μM引物储存液。取5μM的RT引物储存液1μL，加入79μL的RNase-free water，配制成62.5 nM的RT引物工作液。将2μL逆转录miR-125b引物（0.5μg/μL）和2.0μg Total RNA 加入到 PCR 小管中，补RNase-Free H2O至11μL;混匀后离心，70°C温浴10 min;之后立即置于冰水混合物中冰浴，使逆轉录引物和模板退火在上述混合物中按下表的比例，在冰浴中进行反应体系（25μL 体系）配制，混匀，短暂离心。上述体系在42°C水浴反应1h，然后在70°C水浴10 min使RT酶失活，将得到的逆转录miR-125b cDNA，置于-20°C保存备用。将1μLOligo dT（0.5μg/μL）和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H2O至10μL，混匀后离心，70°C温浴，10 min，之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火，按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心。miR-125b类似物序列：正向引物 5'-GCGCTCCCTGAGACCCTAAC-3'，反向引物 5'-TGCAGGGTCCGAGGTAT- 3'。最后应用实时荧光定量多聚酶链反应（real time quantitative-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测miR-125b的表达，采用SDS2.4软件进行数据分析，Ct阈值设为0.2，对miR-125b在颈动脉损伤模型大鼠ASMCs表达进行分析。

1.4 ASMCs细胞转染miR-125 mimics

将1×105细胞置于24孔板中培养至贴壁，加入含6μg/ml嘌呤的培养基培养，并加入适量含miR-125b mimics的病毒，转染4小时后加新鲜培养基稀释嘌呤。继续培养24小时后用新鲜培养基替换含嘌呤的培养基，48小时后使用qRT-PCR检测转染效率。

1.5 CCK-8检测

将ASMCs置于96孔板中，分为对照组和miR-125b组，培养24小时后加入CCK-8试剂，并孵育1-4小时。最后酶标仪测定在450nm处的吸光度。

1.6 细胞Transwell试验及划痕试验

将ASMCs加入Transwell上室，使用无血清培养基培养，分为对照组和miR-125b组。在24孔板中加入10%胎牛血清的培养基。将小室置于24孔板中培养6-8小时后取出上室，固定、染色，显微镜下计数迁移细胞数。

先在12孔背面划上兩条横线，将1.5×105细胞置于12孔板中，分为对照组和miR-125b组。待细胞贴壁后划痕并拍照，培养24h后拍照，计算划痕迁移率。

1.7 统计学方法

本实验数据采用SPSS18.0软件进行处理，应用t检验分析两组样本间的数据。P<0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 ASMCs中过表达miR-125b

从构建的15只Wistar大鼠颈动脉球囊损伤模型中提取ASMCs，并使用miR-125b转染ASMCs。使用qRT-PCR检测转染效率发现，miR-125b在miR-125b组的表达约是其在对照组的2.3倍（P<0.001）（图1，表1）。

2.2 过表达miR-125b对ASMCs增殖的影响

使用CCK8实验比较miR-125b组和对照组ASMCs的增殖能力，结果显示miR-125b组的OD450/fold值约是对照组的0.469倍（P<0.001）（图2，表1）。这提示miR-125b可抑制ASMCs的增殖。

2.3 过表达miR-125b对ASMCs迁移的影响

使用划痕实验和Transwell迁移实验比较miR-125b组和对照组ASMCs的迁移能力。划痕实验结果显示miR-125b组的划痕迁移率约是对照组的的0.881倍（P=0.009）（图3A，表1）。Transwell迁移实验结果显示miR-125b组的细胞迁移倍数约是对照组的的0.716倍倍（P<0.001）（图3B，表1）。两组实验均提示miR-125b可抑制ASMCs的迁移。

3 讨论

动脉硬化的病理生理过程是一个多机制参与的复杂过程，其中微小核糖酸是该过程的重要调节因子。miR-125b在乳腺癌、膀胱癌及肝癌等肿瘤细胞的增殖和迁移中发挥作用。动脉硬化的发展过程和肿瘤转移有相似之处，如ASMCs过度增殖、迁移导致血管内膜增厚。因此我们推测miR-125b在ASMCs的增殖和迁移过程中亦发挥作用。

近年来，越来越多的证据表明，microRNA可以通过调节VSMCs而影响AS的发生和发展。先前的研究已经证实miR-21，miR-1298和miR-22-3p参与了AS的发病机制。例如，miR-21可以通过靶向磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）来调节VSMC的增殖和迁移，从而影响AS的发病机理和进程。miR-1298的缺失与AS的CpG甲基化有关，而miR-1298的下调通过直接靶向连接蛋白43（connexin-43）来调节VSMC的增殖和迁移[10]。miR-22-3p可靶向高机动性组合箱-1 （high mobility group box-1，HMGB1）而抑制ASMCs的迁移和增生能力。

综述所述，以Wistar大鼠为研究对象，以球囊摩擦方法制备大鼠颈动脉损伤模型是可行的。

参考文献

[1]? 尹智明，余朝文. 下肢动脉硬化闭塞症腔内介入治疗的研究进展[J]. 中国普通外科杂志， 2017， 26（6）：789-793.

[2]? 陈世远，王孝高，聂中林，等. 辛伐他汀干预临床前期下肢动脉硬化闭塞症病程进展的临床研究[J]. 中华解剖与临床杂志， 2015， 20（2）：136-138.

[3]? 张宇，张志伟，吴继东，等. 膝以下动脉硬化闭塞症的介入治疗 [J]. 解剖与临床， 2013： 18（5）：411-414.

基金项目：

蚌埠医学院自然科学基金重点项目（BYKY1862ZD）;安徽省高校自然科学重大项目（KJ2016SD38）;安徽省科技攻关项目：（201904a07020020）

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