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LAMP芯片法检测下呼吸道感染性疾病病原体的价值

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魏晓楠王娜伊茂礼弭苗苗张贵丽孙成铭

[摘要] 目的利用環介导恒温扩增（LAMP）芯片法对疑似下呼吸道感染病人进行13种病原体检测，评价该方法的临床应用价值。方法收集2017年就诊于我院的疑似下呼吸道感染病人的深部痰液标本2 029例及肺泡灌洗液标本246例，分别采用LAMP芯片法和分离培养技术对病原体进行检测。以培养法为“金标准”，对LAMP芯片法进行方法学评价。结果在深部痰液标本中，LAMP芯片法和普通培养法检测的总阳性率分别为57.96%（1 176/2 029）和10.50%（213/2 029），差异具有统计学意义（χ2=101.511，P<0.01）;两种方法对铜绿假单胞菌的检出一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。痰液标本中流感嗜血杆菌的检出率最高，为21.24%（431/2 029）。深部痰液和肺泡灌洗液检出的病原体种类及阳性率均存在明显差异。结论 LAMP芯片法可对下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原体，尤其是苛养菌和不可培养病原体进行快速检测，其检出阳性率明显高于传统培养法，且其检测快速可靠，适于在基层医院中推广。

[关键词] 呼吸道感染;病原;核酸扩增技术;芯片分析技术

[中图分类号] R446.5;R517.6 ?[文献标志码] A ?[文章编号] 2096-5532（2020）02-0207-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.053 [开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200325.1005.005.html;2020-03-026 11：30

[ABSTRACT] Objective To evaluate the clinical value of the on-chip loop-mediated isothermal amplification （LAMP） assay by testing patients with suspected lower respiratory tract infection （LRTI） for 13 pathogens using the LAMP assay. ?MethodsA total of 2 029 deep sputum specimens and 246 bronchoalveolar lavage fluid （BALF） specimens were collected from patients with suspected LRTI who attended our hospital in 2017. The patients were tested for pathogens using the on-chip LAMP assay and pathogen isolation and culture technique. The methodology of the on-chip LAMP assay was evaluated using the pathogen culture method as the “gold standard”. ?Results The overall positive rates of the on-chip LAMP assay and conventional culture method in sputum specimens were 57.96% （1 176/2 029） and 10.50% （213/2 029）， respectively， with a significant difference observed between the two methods （χ2=101.511，P<0.01）. The two methods had the highest detection consistency for Pseudomonas aeruginosa （Kappa=0.651，95% confidence interval： 0.561-0.741）. The detection rate of Haemophilus influenzae in sputum specimens was highest （21.24%，431/2 029）. There were significant differences in the type and positive rate of pathogens between deep sputum and BALF specimens. ?Conclusion The on-chip LAMP assay can be used for rapid detection of pathogens in sputum and BALF specimens collected from patients with LRTI， especially the fastidious bacteria and non-culturable pathogens， the positive detection rate for which is significantly higher than that with conventional culture method. The LAMP assay is fast and reliable， which makes it suitable for application in primary hospitals.

[KEY WORDS] respiratory tract infections; noxae; nucleic acid amplification techniques; microchip analytical procedures

2.4 两种方法检测结果的一致性分析

在痰液标本中，普通培养法检测的总阳性率为10.50%（213/2 029），与LAMP芯片法比较差异具有统计学意义（χ2=101.511，P<0.01）。LAMP芯片法与培养法检出病原体共同阳性174例，LAMP芯片法检出阳性而培养法阴性1 559例，两种方法检测结果一致性见表4。在13种病原体中，两种方法检出铜绿假单胞菌的一致性最高（Kappa=0.651，95%CI=0.561～0.741）。

3 讨 ?论

下呼吸道感染是一个全球范围的严重公共卫生问题，它常为多种呼吸系统疾病的诱因，并涉及种类繁多的病原体。目前，在短時间内做出明确的病原学诊断并进行有针对性的治疗依然很困难，这也是该病死亡率高的主要原因[6]。实践证明，定期或者不定期地对呼吸道疾病的流行病学特征进行统计分析，可以为疾病预防控制提供干预依据[7]。预防为主、准确诊断、及时治疗，是防治该病的基本原则，而明确引起感染的病原体和针对性药物的选择配伍则是降低该病死亡率的重要保证。下呼吸道感染多由细菌、病毒、支原体、衣原体等病原体引起[8]，受目前技术所限，除细菌外的其他病原体的常规培养，临床微生物室尚难以开展。因此，一种特异性高、覆盖面广、检测灵敏快速的病原体诊断方法——LAMP技术应运而生。

2000年，这种以链置换酶核酸扩增为基础的LAMP被NOTOMI等[9]首次报道。LAMP利用针对6个靶基因区域而设计的4对特异性引物，通过链置换DNA聚合酶在恒温条件下（65 ℃左右），形成一系列不同大小的具有多个靶DNA反向重复串联序列的产物。该方法不需要传统PCR的严苛条件和观察步骤，整个反应过程仅需15～60 min即可完成[10]。LAMP从标本处理到报告结果全过程仅需2 h，尤其适用于基层医院及军队野战医院，故一经报道就受到了广泛的关注[11]。LAMP的特异性和敏感性很高，操作及检测方法简单，且芯片法检测结果不易出现污染、自动化程度高、试剂损耗低、检测病原体覆盖面广，具备了对呼吸道感染性疾病的快速诊断能力[12]。

本研究以商品化LAMP试剂盒对疑似下呼吸道感染病人的标本进行了13种病原体的检测，结果表明，流感嗜血杆菌是最主要下呼吸道致病菌，其次为肺炎链球菌和肺炎支原体，该结果与我院同期微生物室呼吸道标本分离细菌分布情况大致相同，但与同年全国细菌耐药监测网发布的数据略有差异。这可能与地域差异有关;另外，由于流感嗜血杆菌对环境的要求较为严格，采集及运输方式不当，对培养阳性率的影响也较大[13]。本研究中，女性病人肺炎支原体的阳性率较男性高，而男性病人肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌的阳性率高于女性。这可能与女性和男性的生理及免疫差异有关，具体机制尚需进一步研究。各年龄组间比较，8种下呼吸道病原体阳性率差异有统计学意义，提示下呼吸道病原体感染与年龄有一定的关系。这与郑才玲等[14]的报道较为一致。流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、肺炎支原体的阳性率在少年组最高，这与少年人群免疫系统发育尚不成熟，且长期活动于学校等人群密集度较高的场所，呼吸道病原体的传播更容易且迅速，从而导致相关病原体阳性检出率偏高[15]。肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌阳性率则在老年组最高，这与老年病人基础疾病多、住院率高、院内感染率高有关。深部痰液和肺泡灌洗液检出的病原体种类及阳性率均存在明显差异，肺泡灌洗液中流感嗜血杆菌的检出率较低，而肺炎支原体的检出率较高。这可能是由于不同病原体的定植位置不同而导致的，肺炎支原体常黏附于肺泡上皮细胞上，通过肺泡灌洗后能于灌洗液中富集，因此检出率会更高[16];而流感嗜血杆菌等常定植于上呼吸道，因此通过自然咳痰的方法更易被检出[17]。

LAMP芯片法对某些苛养菌（如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等）的检出率比常规培养法更高，对支原体等难以常规培养的病原体更有培养法所无法比拟的优势。由于抗生素的广泛使用，很多病人在留取标本前可能已经使用了某些抗生素，这会对培养的阳性率造成严重影响;另外，某些病原体对培养条件要求苛刻，需要特殊的培养基才能生长，培养困难或根本无法培养，这也是造成培养阳性率低的一大因素。如流感嗜血杆菌培养条件特殊，X因子（正铁血红素）、V因子（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）是其生长的必须因子，临床分离、培养时巧克力平板的V因子在常温或高温下容易失去活性，导致流感嗜血杆菌在培养基上生长差或不生长，经常被漏检[18]。肺炎链球菌在体外生存能力较弱，对培养的营养要求高，可产生自溶酶，在经验不足的基层实验室中使用普通培养基或涂片革兰染色检查可将其与草绿色链球菌混淆，培养和菌种菌型鉴别过程复杂，导致培养法阳性率较低[19]。LAMP技术可从标本极其微量的核酸中获取目的基因[20]，并进行扩增和放大，灵敏度较普通培养法有质的提高。本研究结果还显示，两种方法的诊断一致性较好，尤其是对铜绿假单胞菌的检出一致性最高，Kappa值可达0.651。由于婴幼儿的依从性较差，合格的痰培养标本难以获取，因此病原体阳性检出率低是困扰婴幼儿下呼吸道感染诊断的关键问题[21]。LAMP技术由于采用了特异性引物进行扩增，在保证了高度特异性的前提下[22]，大大提高了检出阳性率，这使得该技术在婴幼儿下呼吸道感染病原体诊断方面具有绝对的优势。LAMP芯片法还可对结核分支杆菌复合群、军团菌[23]、衣原体这3种无法常规培养的病原体同时进行检测，可使病原体的覆盖面更广，大大提高了诊断的灵敏度[24]。本研究中检出军团菌4例，结核分支杆菌复合群28例，衣原体10例。28例结核分支杆菌复合群中，17例抗酸杆菌涂片阴性，我们又对扩增产物进行了测序验证，符合率100%，病人抗结核治疗有效。表明LAMP芯片法可以帮助临床快速诊断下呼吸道感染并指导临床合理用药。

综上所述，本研究采用LAMP芯片法检测了本地区疑似下呼吸道感染病人的病原体分布情况，结果显示病原体以流感嗜血杆菌为主，与同期全国细菌耐药监测网发布的数据略有差异;该方法可对下呼吸道感染病人痰液及肺泡灌洗液中的病原体，尤其是苛养菌和不可培养病原体进行快速检测，检出阳性率明显高于传统培养法。LAMP芯片法操作简单，可同时检测多种病原体，适宜在基层医院中推广和应用。

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（本文编辑马伟平）

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