| 标题 | 跑台运动对TgAPP/PS1小鼠海马Aβ转运清除的影响 |
| 范文 | 何标 梁艳 徐波 黄柔 闫清伟 李百侠 梁菲 于海珍 毛倩 赵慧 张宪亮 摘 要：探討12周中等强度跑台运动对AD小鼠海马内Aβ转运清除的影响。选3月龄雄性Tg APP/PS1小鼠，随机分为转基因运动组（TE，n=12只）和转基因安静组（TC，n=12只）；选同窝野生型小鼠作为正常对照组（C，n=12只）和运动对照组（E，n=12只）。E组和TE组小鼠给予12周中等强度的跑台运动，C组和TC组安静饲养。选用蛋白质免疫印迹法检测小鼠海马LRP-1和RAGE蛋白相对表达水平；选用酶联免疫吸附试验测定小鼠海马Aβ40、Aβ42，血液Aβ40、Aβ42、sLRP-1和sRAGE的质量浓度。结果：1）TE组小鼠海马Aβ40（P<0.05）和Aβ42质量浓度（P<0.05）较TC组显著下降，TE组小鼠血液Aβ40（P<0.01）和Aβ42质量浓度（P<0.01）较TC组显著下降。2）TE组小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平（P<0.01）和血液sLRP-1质量浓度（P<0.05）较TC组显著升高。3）TE组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平（P<0.01）和血液sRAGE质量浓度（P<0.01）较TC组显著下降。结果说明，12周中等强度的跑台运动通过上调海马LRP-1的蛋白相对表达水平，提高血液sLRP-1的质量浓度，下调海马RAGE的蛋白相对表达水平，降低血液sRAGE的质量浓度，提高Tg APP/PS1小鼠海马Aβ40和Aβ42的转运清除速率。 关 键 词：运动生物化学；跑台运动；海马Aβ转运；阿尔茨海默病；β淀粉样蛋白；小鼠 中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2018）04-0134-06 Abstract： In order to probe into the effects of a 12-week medium intensity treadmill exercise on Aβ transfer and removal in AD mouse hippocampus， the authors selected 3 months old male Tg APP/PS1 mice， randomly divided them into a transgenic exercise group （TE， n=12） and a transgenic calm group （TC， n=12）， selected littermate wild mice as a normal control group （C， n=12） and an exercise control group （E， n=12）， let the mice in groups E and TE do a 12-week medium intensity treadmill exercise， bred the mice in groups C and TC in a calm condition， tested the protein relative expression levels of mouse hippocampus LRP-1 and RAGE by means of western blotting， measured the mass concentrations of mouse hippocampus Aβ40 and Aβ42， blood Aβ40， blood Aβ42， blood sLRP-1 and blood sRAGE by means of ELISA， and revealed the following findings： the mass concentrations of hippocampus Aβ40 （P<0.05） and Aβ42 （P<0.05） of the mice in group TE decreased significantly as compared with those of the mice in group TC； the mass concentrations of blood Aβ40 （P<0.01） and Aβ42 （P<0.01） of the mice in group TE decreased significantly as compared with those of the mice in group TC； 2） the protein relative expression level of hippocampus LRP-1 （P<0.01） and the mass concentration of blood sLRP-1 （P<0.05） of the mice in group TE increased significantly as compared with those of the mice in group TC； 3） the protein relative expression level of hippocampus RAGE （P<0.01） and the mass concentration blood sRAGE （P<0.01） of the mice in group TE decreased significantly as compared with those of the mice in group TC. The said findings indicated the followings： By increasing the protein relative expression level of hippocampus LRP-1， the 12-week medium intensity treadmill exercise increased the mass concentration of blood sLPR-1， decreased the protein relative expression level of hippocampus RAGE， decreased the mass concentration of blood sRAGE， and increased the hippocampus Aβ40 and Aβ42 transfer and removal rate of Tg APP/PS1 mice. Key words： sports biochemistry；treadmill exercise；hippocampus Aβ transfer and removal；Alzheimer disease；Aβ；mouse 阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种与年龄相关的进行性神经退行性疾病，以渐进的记忆丢失和认知功能障碍为主要临床特征，以海马神经元丢失、神经纤维缠结和细胞外老年斑为主要病理特征[1]。“Aβ学说”认为脑内Aβ的生成和清除失衡引起Aβ聚集加速，导致AD的发生[2]。家族型AD（familial Alzheimers disease，fAD）（仅占总发病的5%）因过表达AD致病基因，导致Aβ生成增多；而散发性AD（sporadic Alzheimers disease，sAD）（占总发病的95%）主要是由脑内Aβ清除功能障碍引起的[3]。脑内Aβ的清除对延缓Aβ异常聚集具有重要作用[4]。机体清除Aβ的主要途径是通过转运功能将脑内的Aβ转出脑组织并进入外周血液[5]。该途径主要是在低密度脂蛋白受体相关蛋白1（low density lipoprotein receptor-related protein-1，LRP-1）和晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）作用下完成的，脑内Aβ转运到外周是一个双向的过程，LRP-1是Aβ由脑内运至外周组织的主要载体，RAGE则是Aβ从外周运至脑内的主要载体，LRP-1功能异常或表达减少降低了脑内Aβ的转运速率，增加脑内可溶性Aβ的浓度，最终导致脑内老年斑积聚速度加快[6]。与正常大脑相比，AD患者腦内Aβ的清除能力降低了约30%左右[7]。 研究表明：长期中等强度的有氧运动可以延缓AD的病理进程[8]。运动通过抑制Aβ生成降低脑内Aβ的含量已经得到证实[9]。运动通过提高Aβ降解酶活性和激活小胶质细胞的吞噬功能加速Aβ的清除也得以证实[10]。目前，鲜有运动对Aβ转运清除方面的研究，鉴于上述研究现状，本实验就运动对TgAPP/PS1小鼠海马内Aβ的转运清除进行研究，为阐述运动预防和缓解AD的发生提供理论和实践依据。 1 实验材料及方法 1.1 实验动物及分组 选3月龄雄性Tg APP/PS1小鼠，随机分为转基因运动组（TE，n=12只）和转基因安静组（TC，n=12只），选同窝野生型小鼠作为正常对照组（C，n=12只）和运动对照组（E，n=12只）。T组和TE组小鼠给予12周中等强度的跑台运动，C组和TC组安静饲养。实验动物置于标准动物房，常规分笼饲养，自由饮食进水，自然光照。（鉴于该种系小鼠死亡率高，为防止实验过程中小鼠意外死亡，实际实验小鼠多于48只）。 1.2 运动方案 把实验小鼠置于标准动物房适应性喂养2周，然后进行1周的适应性跑台训练：先将E组和TE组小鼠置于静止的跑台上适应2 d，每天30 min，第3天开始进行15 min的跑台训练，第4天进行30 min的跑台训练，第5天进行45 min的跑台训练，第6天和第7天休息。随后，E组和TE组小鼠进行为期12周的跑台训练，每周5次，每次训练持续45 min，速度为9 m/min，每天下午16：00进行跑台训练，训练强度参照文献[11]进行，运动强度为小鼠最大摄氧量的45%～55%。 1.3 取材 小鼠末次运动后，禁食12 h，摘除眼球取血；脱颈处死，取左右侧海马置-80 ℃冰箱，待测。所有操作均在冰上进行。 1.4 酶联免疫吸附剂测定海马内Aβ40和Aβ42的质量浓度 取10～20 mg海马，按1∶10（质量比）加入PBS溶液，重复均浆2～3次，12 000 g/min低温离心20 min，取上清检测海马Aβ40和Aβ42质量浓度，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值D（λ），通过标准曲线计算样品中Aβ40和Aβ42的质量浓度。 1.5 酶联免疫吸附剂测定血液Aβ40、Aβ42、sLRP-1和sRAGE的质量浓度 小鼠末次运动后，禁食12 h摘眼球取血，置于离心管内，4 ℃静置过夜，4 000 r/min离心20 min，取上清置离心管内，检测血液Aβ40、Aβ42、sLRP-1和sRAGE的质量浓度，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行：每孔先加样品稀释液40 μL，然后再加待测样品10 μL（最终稀释样品浓度5倍），用酶标仪在450 nm波长下测定光密度值D（λ），通过标准曲线计算样品中所含Aβ40、Aβ42、sLRP-1和sRAGE的质量浓度。 1.6 蛋白质免疫印迹法检测海马LRP-1和RAGE蛋白相对表达水平 取20～30 mg海马组织，按1∶7（质量比）加入混有PMSF的裂解液，重复均浆3～4次，12 000 g/min低温离心5 min，取上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。用SDS-PAGE进行凝胶电泳，进行PVDF转膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加一抗稀释液（LRP-1，ab92544，1∶1 000；RAGE，ab172473，1∶1 000），4 ℃摇床过夜，次日加二抗，孵育2 h，TBST摇床洗3次，暗室ECL显影，用AIpha成像系统曝光，ImageJ1.46进行灰密度值分析，将目的蛋白与内参平均密度的比值作为目的蛋白相对表达水平。 1.7 统计分析 用SPSS18.0软件对所获数据进行统计分析，所有数据用均数±标准差（ ±s）表示，组间比较采用双因素方差分析（Two-way ANOVY），事后比较采用LSD法，P<0.05表示差异有显著性统计学意义，P<0.01表示差异有非常显著性统计学意义。 2 结果及分析 2.1 运动对小鼠海马Aβ40和Aβ42的影响 实验结果显示，与C组比较，TC组小鼠海马Aβ40的质量浓度升高，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）。与TC组比较，TE组小鼠海马Aβ40的质量浓度下降，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）。与C组比较，TC组小鼠海马Aβ42的质量浓度升高，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）。与TC组比较，TE组小鼠海马Aβ42的质量浓度下降，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）（见表1）。 2.2 运动对小鼠血液Aβ40和Aβ42的影响 实验结果显示，与C组比较，E组小鼠血液Aβ40的质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与C组比较，TC组小鼠血液Aβ40的质量浓度上升，差异具有显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE组小鼠血液Aβ40的质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与C组比较，E组小鼠血液Aβ42的质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）。与C组比较，TC组小鼠血液Aβ42的质量浓度上升，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE组小鼠血液Aβ42的质量浓度降低，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）（见表2）。 2.3 运动对小鼠海马LRP-1和RAGE蛋白相对表达水平的影响 蛋白实验结果显示，与C组比较，E组小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平提高，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）；与C组比较，TC组小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平降低，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE組小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平提高，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）。蛋白实验结果显示，与C组比较，E组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平下降，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）；与C组比较，TC组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平升高，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平降低，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）（见表3）。 2.4 运动对小鼠血液sLRP-1和sRAGE的影响 与C组比较，E组小鼠血液sLRP-1质量浓度升高，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）；与C组比较，TC组小鼠血液sLRP-1质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE组小鼠血液sLRP-1质量浓度升高，差异具有显著性统计学意义（P<0.05）。与C组比较，E组小鼠血液sRAGE质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）。与C组比较，TC组小鼠血液sRAGE质量浓度上升，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）；与TC组比较，TE组小鼠血液sRAGE质量浓度下降，差异具有非常显著性统计学意义（P<0.01）（见表4）。 3 讨论 本研究发现，Tg APP/PS1小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度均显著高于野生型小鼠，说明本实验选用的Tg APP/PS1小鼠能够成功模拟AD病理特征，即脑内含有较高质量浓度的Aβ。通过比较两组转基因小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度发现，转基因运动组小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度显著下降，说明本实验选用的运动方案能够有效降低Tg APP/PS1小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度，进而达到延缓AD病理进程的目的。对两个野生型小鼠的比较发现，运动组小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度较对照组低，但差异均不具有显著性统计学意义，说明野生型小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度处于较低水平，可经过正常的机体代谢使其维持在合理的范围内，而转基因运动组小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度显著下降，可能是运动对较高质量浓度的Aβ40和Aβ42产生更好的调节效果。已有研究证实，对Tg APP/PS1小鼠进行6周无刺激的跑台运动（10 m/min，每周5次）发现，与安静组比较，运动组小鼠海马Aβ40和Aβ42质量浓度显著降低[12]。近期的研究证实，对Tg NSE/APP小鼠进行7周的跑台运动后发现，运动组小鼠皮层Aβ40和 Aβ42的质量浓度较安静组显著降低[13]。 Aβ是一类由39～42个氨基酸组成的小分子疏水肽，以Aβ40和Aβ42最为人们所熟知，也是老年斑的主要成分，其中以对神经细胞毒性较大的Aβ42为主要成分，Aβ42的积聚速率大于清除速率，就会导致Aβ42细胞外异常沉积，进而导致AD的发生[14]。因此，提高Aβ的清除速率对延缓AD的病理进程至关重要[15]。促进Aβ从脑内向血液流出，抑制血液中的Aβ流向脑内是降低脑内Aβ的重要手段[16]。LRP-1是Aβ转运至外周的主要载体，本实验证实，Tg APP/PS1小鼠海马Aβ外转蛋白LRP-1蛋白相对表达水平显著降低，Aβ内转蛋白RAGE蛋白相对表达水平显著提高，血液sLRP-1质量浓度显著降低，血液sRAGE质量浓度显著提高，说明该小鼠海马内Aβ外转速率下降，外周血液Aβ内转速率提高，导致海马内Aβ质量浓度增加。经过12周的跑台运动，转基因运动组小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平和血液sLRP-1质量浓度较转基因对照组显著增加，而转基因运动组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平和血液sRAGE质量浓度较转基因对照组显著降低。因此，跑台运动可能通过上调海马Aβ外转蛋白LRP-1蛋白相对表达水平和血液sLRP-1的质量浓度，下调了内转蛋白RAGE蛋白相对表达水平和血液sRAGE质量浓度，进而降低了Tg APP/PS1小鼠海马Aβ40和Aβ42的质量浓度。研究证实，对6月龄Tg2576小鼠进行3个月的跑台训练后发现，运动组小鼠海马LRP-1蛋白相对表达水平较对照组显著提高，且效果高强度运动优于低强度运动[17]。 RAGE能够与配体结合引起机体的炎症反应，被视为炎症受体因子。此外，RAGE与Aβ在血脑屏障的管腔膜处结合，调节Aβ通过血脑屏障进入脑实质的速率[18]。与其他小分子肽相比，RAGE介导Aβ的内流速度是其他分子的2～3倍。本研究发现，TgAPP/PS1小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平显著高于野生型小鼠，而转基因运动组小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平较转基因对照组低，实验结果提示，跑台运动能够降低TgAPP/PS1小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平，降低外周血液Aβ入脑的速率。但有研究发现，与安静对照组比较，12 d的自主跑轮运动显著降低侧脑室注射Aβ25-35导致AD小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平[19]。还有研究证实，与安静对照组比较，10周的跑台运动对4月龄TgAPP/PS1小鼠海马RAGE蛋白相对表达水平没有产生显著影响[20]。本实验结果与上述实验结果不一致，其可能的原因是由选用实验小鼠的月龄不一致导致的。 血液中的Aβ主要来源于脑内，血液中Aβ仅占脑脊液Aβ 1%左右，但血液中Aβ质量浓度的变化是早期检测AD的重要指标，Mehta等[21]检测了78例AD患者血液Aβ40的质量浓度后发现：AD患者外周血液Aβ40质量浓度显著高于正常人群。本研究进一步验证了12周中等强度的跑台运动对Tg APP/PS1小鼠外周血液Aβ40和Aβ42质量浓度的影响，结果发现，与野生型小鼠比较，转基因安静组小鼠血液Aβ40和Aβ42的质量浓度均显著升高，与各自安静组比较，正常运动组和转基因运动小鼠外周血液Aβ40和Aβ42的质量浓度显著降低。脑内Aβ进入外周血液后以可溶性的形式存在，血液中可溶性Aβ可以与多种分子颗粒结合形成复合物，LRP-1在外周血液以可溶性的LRP-1（sLRP-1）存在，sLRP-1是外周组织与Aβ结合的主要蛋白，能够结合约90%的Aβ，Aβ与sLRP-1结合所形成的复合物能够被肝脏和肾脏清除。AD病人血液中sLRP-1的质量浓度显著低于正常人群，导致外周清除Aβ的能力下降[22]。本研究进一步检测了12周中等强度的跑台运动对TgAPP/PS1小鼠血液sLRP-1和sRAGE质量浓度的影响，研究结果显示，转基因安静组小鼠血液sLRP-1的质量浓度显著低于正常对照组小鼠，与各自安静组比较，运动对照组和转基因对照组小鼠血液sLRP-1质量浓度显著升高。与安静对照组比较，转基因安静组小鼠血液sRAGE的质量浓度显著高于正常对照组小鼠，与各自安静组比较，运动对照组和转基因对照组小鼠血液sRAGE质量浓度显著下降，提示12周中等强度的跑台运动通过提高血液sLRP-1的质量浓度，降低血液sRAGE的质量浓度，从而降低了血液Aβ入脑的速率，加速外周Aβ的清除。 Tg APP/PS1小鼠海马及外周血液Aβ40和Aβ42的质量浓度较同窝野生型小鼠均显著升高，其海马LRP-1蛋白相对表达水平和血液sLRP-1质量浓度均显著降低，海马RAGE蛋白相对表达水平和血液sRAGE质量浓度显著升高。12周中等强度的跑臺运动能够降低TgAPP/PS1小鼠海马和血液Aβ40和Aβ42质量浓度，推测中等强度的跑台运动可能通过提高海马LRP-1蛋白相对表达水平和血液sLRP-1质量浓度，降低海马RAGE蛋白相对表达水平和血液sRAGE质量浓度，进而提高了Tg APP/PS1小鼠海马Aβ向转运速率和外周清除速率，降低Tg APP/PS1小鼠海马和血液Aβ40和Aβ42质量浓度。 参考文献： [1] SCOTT-MCKEAN J J，SUREWICZ K，CHOI J K，et al. 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