| 标题 | 耐力运动对大鼠心肌GR和MR表达的影响 |
| 范文 | 王蕴红+张雪琳+赵明华 摘 要：研究不同训练状态大鼠心肌糖皮质激素受体（GR）和盐皮质激素受体（MR）的表达规律，探讨其在运动心肌适应过程中可能产生的作用。方法：大鼠分别采用一次耐力运动、4周和10周的递增负荷耐力运动训练方案，并在末次运动后0 h、3 h、24 h 取材，采用Western blot 方法测定左室心肌相应的指标。结果：肾上腺重量以及肾上腺/体重在4周和10周的训练大鼠均显著增加；而心肌GR和MR的表达在4周递增负荷耐力训练后与安静对照组比较显著下降，经过10周递增负荷耐力训练后，受体表达量与安静对照组无明显差异。一次、4周和10周的耐力运动对大鼠心肌p-SGK1/SGK1没有明显影响；但心肌HSP70的表达量随着运动训练的持续，呈递增性提高。结论：大鼠心肌GR和MR表达以及受体与配体的亲和力与运动训练状态有关，这些变化可能参与了运动心肌的适应过程。 关键词：运动；心肌；糖皮质激素受体；盐皮质激素受体；血清和糖皮质激素调节激酶1 中图分类号：G 804.2 文章编号：1009-783X（2017）04-0375-04 文献标识码：A Abstract：Objective：To characterize the expression pattern of glucocorticoid receptor （GR） and mineralocorticoid receptor （MR） of different exercise training status in hearts so as to investigate their roles in exercise -induced cardiac adaptation. Methods： Rats were subjected to either a single bout of exercise， 4-week or 10-week exercise training respectively and then euthnized at 0h， 3h and 24h after last run. Protein level of left ventricle was measured by Western blotting. Results： Adrenal weight to body weight ratio was significantly increased in 4-week and 10-week trained rats. After 4-week training， the basal expressions of GR and MR were significantly decreased， but no change was observed in GR and MR expression after 10-week of training. No change was observed in p-SGK1 to SGK1 ratio in all exercised groups， while a significant increase in the expression of HSP70 both in response to acute exercise and at the basal level in the exercise trained rats. Conclusion： The expression pattern of GR and MR， and the affinity of glucocorticoid receptor might influence with training status and these adaptive changes might be involved in exercise-induced cardiac adaptation. Keywords： exercise； cardiac muscle； GR； MR； SGK1 糖皮质激素是主要的应激激素，它对心肌细胞的作用不仅由GR（glucocorticoid receptor）介导，还可由MR（mineralocorticoid receptor）介导[1-3]。研究发现，GR在心脏的正常发育和功能中起关键的作用[3-4]，而MR则在心血管疾病的发生和发展中发挥重要的作用[3，5-6]。另有研究显示，高水平运动员安静时糖皮质激素水平轻微升高，而下丘脑—垂体—肾上腺对急性运动的反应性下降[7]。这些结果提示，循环中糖皮質激素水平与运动诱发的心肌适应可能有关。有报道显示，长期循环中糖皮质激素升高是心脏病独立的致病因素[4]，糖皮质激素能够诱发心肌肥大[8-9]；但也有研究认为，糖皮质激素不仅能刺激促生长的基因表达，还能够促进肌肉萎缩的基因表达[2]。提示激素作用可能与相关受体介导的信号通路激活有关。尽管已有研究表明心肌GR表达受运动训练的影响[10]，但GR和MR在运动心肌表达的规律及其在运动适应中的作用，还未见报道。而阐明GR和MR受体在运动训练中的表达和功能变化规律，有助于认识糖皮质激素在运动诱发心肌功能和结构变化中的作用；因此，我们通过建立不同的运动训练动物模型，观察大鼠心肌GR和MR及相关信号分子的激活水平在运动训练中的变化，探讨其在运动心肌适应过程中可能产生的作用。 1 研究方法 1.1 实验方法 8周雄性SPF级Sprague-Dawley大鼠120只，购自北京维通利华实验动物有限公司[SCXK（京）2012-0001]。经过1周适应性饲养后，随机分组。每组10只，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，自然采光，室温25 ℃ 左右，相对湿度45%～55%。 研究分别采用3个跑台运动训练方案。其中：一次急性运动模型参照Bedford运动方案建立，即大鼠进行一次速度和坡度逐渐递增的1 h耐力运动；4周和10周的运动训练模型则参照本实验室以往耐力训练模型建立。即动物每周训练6 d，1 h/d，坡度、速度逐渐递增，使4周末速度达到 25 m/min，运动时间达到60 min， 坡度10 °，该运动动物能够出现心重/体重升高（见表1）。10周的运动训练方案在前4周同4周训练模型，之后继续递增运动负荷直到速度为 22 m/min， 坡度15 °，该训练方案使运动动物在第5～10周的训练中，受伤率和死亡率随运动周数的增加而递增，到10周末的运动动物训练负荷难以继续增加（见表1）。模型建立后，运动动物在末次运动后的固定时间点（0 h，3 h，24 h）取材，对照组大鼠同时取材，分离心脏和肾上腺，并称重。在预冷生理盐水中冲洗，并分离左室心肌。采用Western blot 方法测定相应指标。GR、MR、pSGK1、SGK1、HSP70抗体等主要试剂购自Epitomics 和Santacruz公司。 1.2 数理统计法 数据均数±标准误或标准差表示，采用SPSS统计软件对western blot结果采用双因素方差分析，Bonferroni法多重比较；肾上腺及肾上腺重/体重2组之间比较，采用t检验处理，显著性水平取P<0.05。 2 结果 2.1 运动大鼠肾上腺重量变化 4周和10周的训练大鼠与相应的对照组相比，心重/体重比明显增加（2.93±0.23 VS 3.20±0.26，P<0.05；2.62±0.16 VS 3.02±0.26，P<0.01）。4周和10周的训练大鼠肾上腺重量以及肾上腺重与体重的比值也均显著增加（见表2）。 2.2 运动大鼠心肌GR 和MR表达 一次急性耐力运动后心肌GR的表达未发生明显变化，而经过4周的递增负荷耐力训练后GR的表达显著下降（P<0.05）；但这些训练大鼠末次运动后GR表达水平在运动后即刻明显升高（P<0.05）。经过10周的递增负荷耐力训练后，大鼠心肌GR表达量与安静对照组无明显差异。一次急性耐力运动就能够引起心肌MR的表达提高（P<0.05）；经过4周耐力训练后MR的表达显著下降（P<0.01），而且这些训练大鼠在急性运动后MR表达水平也没有提高（运动后0 h 和3 h表达量都明显低于安静对照组P<0.05或P<0.01）。经过10周的递增负荷耐力训练后，大鼠心肌MR表达量与安静对照组无明显差异（如图1和图2所示）。 2.3 运动心肌血清和糖皮质激素调节激酶1（SGK1）的激活水平 一次急性运动后，p-SGK1/ SGK1在心肌组织中的表达没有显著改变，经过4周、10周的运动训练的大鼠在安静状态和急性运动后，都没有出现该比值的改变，如图3所示。 2.4 运动心肌热休克蛋白（HSP70）的表达 一次急性耐力运动就能够显著提高心肌HSP70的表达（P<0.05），在运动后24 h，心肌表达仍高达安静组的1.5倍（P<0.05）；经过4周耐力训练后的大鼠在安静状态下，心肌HSP70的表达高达对照组2.0倍（P <0.05）。经过10周的耐力训练后，大鼠心肌表达量更进一步升高到8倍之多，与安静对照组相比呈极显著差异（P <0.001），如图4所示。 3 分析与讨论 运动训练对下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴的激活与运动负荷量、强度及持续时间有关[7，10]。我们以往的实验结果显示，0 o坡度耐力训练模型的大鼠肾上腺重量和肾上腺/体重均没有变化，而本实验中，当提高跑台坡度时，肾上腺重量则显著提高，前人的研究也证实这一点[11]，这表明运动训练的应激程度与肾上腺重量增加密切相关。此外，运动训练所诱发的血浆肾上腺皮质激素升高及细胞浆内受体的结合能力也呈动态变化，长期大负荷运动的大鼠血清游离皮质酮浓度没有明显变化，但糖皮质激素受体的结合能力升高[12]。由此推测，运动导致GR和MR受体表达和活性的变化，也可能与运动训练量和训练状态有关。 心肌存在GR 和MR两种受体，并且都能与糖皮质激素、盐皮质激素结合；但两受体对激素的亲和力不同。由于GR对醛固酮的亲和力远低于MR，只有在极大剂量醛固酮存在的情况下，GR才能产生醛固酮样效应，而MR与盐皮质激素和糖皮质激素的亲和力相当；但由于循环中糖皮质激素水平远高于醛固酮，因此，MR主要介导心肌糖皮质激素信号的调节作用[5]。由此推测，运动训练大鼠的心肌GR和MR主要介导了糖皮质激素对心肌的作用。 糖皮质激素直接作用于GR，通过调节钙稳态而对心肌的收缩性产生影响[13]，还能抑制缺血/再灌引起的心肌细胞凋亡[14]。新近的研究显示，糖皮质激素可直接诱导心肌细胞肥大，使心肌肥大的标志基因ANF mRNA、β-MHC mRNA及SKA mRNA的表达升高，上调IGF-I（IGF-IR）、IL-6（IL-6R）和α1肾上腺素能受体等促进心肌肥厚形成的受体表达[8]。目前还没有运动诱发糖皮质激素升高对运动心肌结构影响的报道，仅有一项研究显示，当给予运动大鼠外源性糖皮质激素时，能够使心肌肥大更为显著[9]；但我们的研究模型仅观察到10周训练大鼠心重/体重升高，并没有观察到运动诱发GR和MR表达量的升高，相反，当训练到4周时，心肌肥大的信号通路Akt/mTOR呈持续激活状态，GR和MR表达却显著下降，而当进一步训练导致Akt/mTOR信号通路激活水平恢复到安静状态时，GR和MR表达量也恢复到安静水平。这说明GR和MR的表达受训练水平和训练状态的影响，而与运动诱发心肌肥大信号通路的激活水平不平衡。这种表达变化也与病理因素诱发的GR表达有明显不同[15]，这种表达量的变化是否起到了心脏保护作用，有待于进一步研究证实。 以往研究显示，MR表达提高多与心脏功能的异常如心律失常、细胞凋亡、纤维化、肥大等疾病发生有关[5]，给予MR拮抗剂能够改善这些病理过程，但有关运动诱发心肌MR表达的变化，还未见报道。本研究结果表明，运动训练引起心肌MR表达也随着运动训练状态而变化，提示MR也可能参与了运动心脏功能结构的调节。为了探讨MR的表达变化是否由盐皮质激素作用引起，我们测定了不同训练状态，SGK1磷酸化水平的变化。研究显示，SGK1的基因转录受盐皮质激素介导的MR所调控[16]。SGK1在TAC早期即可被激活，起到改善心肌细胞存活的作用，但慢性活化则导致心力衰竭及心律失常[16-17]；因此SGK1参与了病理过程中心肌功能的调节。而我们的研究结果显示，无论是一次急性运动还是长期的耐力训练，心肌SGK1激活水平都没有显著变化，表明運动诱发的MR表达及在心脏适应性中的作用，是由糖皮质激素作用引起，与盐皮质激素受体及其介导的SGK1信号通路无明显联系。 与此相反，在我们的实验中，随着训练的继续，运动心肌HSP70表达呈现递增性的增加。有研究显示，GR在无糖皮质激素作用时，与细胞质内HSP90、HSP70和HSP56等伴侣蛋白结合，不具有刺激转录的活性，当糖皮质激素进入细胞质后，GR与HSP90 等解离并发生构象改变，使其结合活性发生改变；因此，GR 的结合活性不仅取决于GR的数量，还与GR的配体亲和力相关[18]。只有HSP90与GR 的配体结合域结合后，GR才具有对糖皮质激素的高亲和性。而GR与HSP70作用是形成GR-HSP90 复合体组件的关键，当应激诱发的HSP70与GR复合物产生增加时，会引起GR的亲和力下降[19]。HSP70能够通过与HIP蛋白的相互作用，抑制GR的转录活性[20]，由此推测，运动诱发心肌HSP70表达的升高，可能参与了GR结合活性的调节，这种抑制GR的亲和力，降低GR 结合活性的作用，可能起到了对抗糖皮质激素诱导心肌细胞损伤的作用。 綜上所述，递增负荷耐力运动能够诱发心肌细胞GR和MR表达量发生改变。短期耐力训练（4周）导致心肌GR和MR表达量下降，同时由于心肌HSP70表达升高，降低GR对糖皮质激素的亲和力；而较长时间的耐力训练（10周）通过进一步提高HSP70表达，受体对糖皮质激素的亲和力进一步降低而对运动训练产生适应，其生理机制可能是避免运动诱发糖皮质激素升高而造成心肌的损伤。 4 结论 递增负荷耐力运动能够诱发心肌细胞GR和MR表达量和配体亲和力发生改变，这种变化与运动的量、运动训练的持续时间和训练水平有关，并参与了运动诱发的心肌适应。 参考文献： [1] OAKLEY R H， CIDLOWSKI J A. 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