| 标题 | 金纳米笼胶囊的制备及其在肿瘤细胞药物投放中的应用 |
| 范文 | 钟华等 摘要：纳米胶囊以其独特的优点，在生物医学领域中应用广泛。本工作介绍了一种以金纳米笼为核心，内部装载抗癌药物盐酸阿霉素（DOX），以功能化的DNA纳米材料为外壳并封锁笼口的新型纳米胶囊。这一纳米胶囊集细胞荧光成像、药物靶向投送功能于一体，可通过荧光显微镜识别靶细胞（本实验以人类B淋巴瘤细胞Ramos细胞为研究对象），同时释放药物作用于靶细胞，诱导靶细胞凋亡。该纳米胶囊的研究为肿瘤细胞的诊断及靶向药物研究领域提供了一定的理论研究依据。 关键词：金纳米笼； 淋巴瘤细胞； 脱氧核糖核酸适体； 药物释放； 荧光显微镜 1引言 纳米胶囊是纳米材料的一个重要分支[1，2]，目前在生物医学领域具有广阔的应用前景。纳米胶囊微小的结构具备优良的生物屏障穿透性能，其内部空间赋予了它药物装载的能力，结合一些胶囊体的功能化设计可使之具备药物可控释放能力[3]。纳米胶囊最重要的应用之一是靶向缓释药物的开发[4]。与常规给药相比，纳米胶囊靶向给药技术具备明显的优势，即纳米胶囊可以提高药物的生物相容性，难溶解于水的特效药物可通过纳米胶囊的装载来改善其在生物体内的吸收能力。目前开发的药物约有 40% 是不溶于水的，这大大限制了药物的应用。纳米胶囊技术的出现解决了这个问题。纳米胶囊另一个特点是它可直接将药物运抵靶标病灶并持续释放内含药物，维持药物在病灶的有效浓度[5～7]，提高治疗效果的同时降低药物对人体其它组织或器官的毒副作用[8，9]。这一优点解决了普通药物在吸收及血液运输过程中容易被分解的难题。因此，纳米胶囊的研究成为近年来的热点话题，目前该领域的研究主要集中在纳米胶囊的靶向设计、胶囊载体优化、可控药物释放等方面。 金纳米笼[10，11]是一种新型纳米材料，其制备方法简单，普通实验室即可自行合成制备，金纳米笼良好的生物相容性使其在生物医学领域具有广泛的应用潜力。本研究设计了一种以金纳米笼为内核、DNA纳米复合结构为外壳的新型纳米胶囊，其中空心金纳米笼内核具备药物装载能力，而DNA纳米复合结构外壳包含以下几个功能：其一，可通过其上固载的细胞DNA适体来特异性识别靶标肿瘤细胞，进而将药物载荷靶向目标；其二，可通过其上设计的DNA荧光分子开关实现靶标细胞的高信噪比荧光成像检测（即具有靶标激活的荧光打开式标记能力，减小了探针本身带来的荧光背景）。综上所述，该新型纳米胶囊可实现药物的靶向运输，可跟踪药物的释放情况（药物DOX本身有荧光性能，未释放时存储在金纳米笼内部，其荧光信号被屏蔽，随着释放发生DOX本身荧光信号恢复）。本工作设计的金纳米笼胶囊的结构原理如图1所示。首先，利用金纳米笼中空结构装载抗癌药物盐酸阿霉素DOX，同时采用设计的改良的DNA自组装网状纳米结构[12]通过硫金键共价结合、碱基配对杂交等作用在金纳米笼表面形成密封包装层，将药物封存在金纳米笼体内部，形成载药纳米胶囊。其次，通过对DNA网状纳米结构密封层的功能化设计，在其中引入肿瘤细胞特异性识别DNA适体片段（DNA S8），赋予了金纳米笼胶囊对特定肿瘤细胞的靶向识别能力，使之成为一种靶向药物投送工具。同时，为了便于清晰地监控和跟踪纳米胶囊对特定细胞的识别，在DNA网状纳米结构密封层的设计中还引入了荧光开关机制（DNA aptamerFAM/DNABHQ，即绿色荧光素FAM修饰的DNA适体DNA S8，和荧光淬灭基团BHQ修饰的部分互补DNA片段DNA S9，其碱基序列见表 1 中的DNA S8和DNA S9），只有当金纳米笼胶囊与特定靶标细胞相遇时，才能引发DNA适体（DNA S8）对靶标细胞的特异识别反应，进而借由竞争反应机制使修饰了荧光淬灭团BHQ的DNA片段（DNA S9）从主体结构上脱落下来，恢复DNA适体（DNA S8，一端修饰了绿色荧光素FAM）的绿色荧光，从而实现对靶标细胞的荧光打开式指示。由于荧光开关机制的引入，降低了背景荧光信号的干扰，使得成像信噪比得到优化。由DNA适体介导通过特异性识别作用结合到靶标细胞表面的金纳米笼胶囊，借由细胞内吞作用进入靶标细胞内部，在细胞内吞小泡溶酶体中DNase（脱氧核糖核酸酶）作用下，其表面DNA网状纳米结构密封层外壳逐渐解体，结构变松散，导致装载的DOX缓慢释放出来，由于这种药物本身具有荧光特性，因此释药的过程可以通过激光共聚焦显微镜双荧光通道图片叠加的方式来判断DOX的释放程度。本研究设计的金纳米笼胶囊是一种集细胞特异性识别与荧光标记、药物靶向投送、药物释放过程跟踪功能为一体的新型多功能纳米探针，可为靶向载药系统的基础研究提供参考。 2实验部分 2.1仪器与试剂 KDC140HR高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；JEOL JEM1200EX透射电子显微镜（TEM，日本Hitachi公司）；Leica TCS SP5 II 激光共聚焦显微镜（德国莱卡公司）；THZ82A气浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）。 乙二醇、丙酮、乙醇（烟台三和化学试剂有限公司）；AgNO3（上海化学试剂有限公司），聚乙烯基吡咯烷酮（阿拉丁试剂），Na2S、NaCl（天津博迪化工股份有限公司），AuClO3（中国国药化学公司），盐酸阿霉素DOX（上海生工生物工程有限公司），三（2甲酰乙基）膦酸盐酸TCEP（SigmaAldrich公司），以上试剂均为分析纯。DNA序列购于北京赛百盛生物科技有限公司，碱基序列如表1所示。 2.2银纳米立方体的合成 参考文献＼[13＼] 制备银纳米立方体：调节磁力搅拌油浴锅的转速为 300 r/min，温度为 150 ℃。温度稳定后，移取 6 mL 乙二醇于 100 mL 锥形瓶中，盖上盖子，搅拌下预热 1 h。 分别配制含 3 mmol/L Na2S， 0.18 mol/L 聚乙烯基吡咯烷酮和 0.28 mol/L AgNO3的乙二醇溶液（现用现配）。1 h 后，在溶液中加入 100 μL Na2S溶液，盖上盖子，反应8 min，随后快速加入 1.5 mL 聚乙烯吡咯烷酮和 0.5 mL AgNO3，继续反应 15 min，观察颜色由黄色变为红褐色继而变为不透明的灰绿色后停止反应，迅速冷却至室温。用丙酮（丙酮体积为反应液的一倍）冲洗反应液并于 9000 r/min 下离心分离。移去上清液，产物用去离子水超声重分散并于 10000 r/min下离心分离 30 min，重复3次。将终产物超声分散到 4 mL 去离子水中，4 ℃ 下密闭避光保存。 2.3金纳米笼的合成 合成办法同样参考文献＼[13＼]，金纳米笼的生长时间控制稍有不同，具体反应时间取决于实验室环境，最终反应时间以合成产物的紫外吸收数据确定。磁搅拌下，取银纳米立方体 100 μL 加入到 5 mL 去离子水溶液（含 1 g/L 聚乙烯基吡咯烷酮）中，加热至微沸。回流10 min后，将 0.1 mmol/L AuClO3溶液用注射泵以 45 mL/h 的速率注入反应液中，直至反应液紫外吸收峰位于800 nm为止。去除加热装置，继续回流 30 min直至溶液颜色稳定，缓慢冷却至室温。反应液中加入NaCl至饱和，9000 r/min 下离心30 min，所得沉淀物用二次蒸馏水重分散，随后 10000 r/min下离心30 min，重复3次。产物超分散于去离子水中，4 ℃下密闭避光保存。 2.4金纳米笼胶囊的制备 2.4.1DNA序列S3及S6的预处理[12＼] 将回文DNA序列S3及S6的母液各自加热到90 ℃，然后程序缓慢降温（退火），1 h内降至18 ℃。最终得到各自的双链结构单元，记为dS3和dS6， 按使用浓度逐级稀释备用。 2.4.2自组装杂交法制备DNA纳米封装材料（1） 1 mL 10 μmol/L DNA S1溶液（10 mmol/LPBS缓冲溶液， pH 7.4），与 1 mL 10 μmol/L DNA S2 溶液（10 mmol/L PBS缓冲溶液， pH 7.4）混合，37 ℃杂交反应2 h，产物冷藏备用。 （2） 将 1 μmol/L DNA dS3、DNA S4、DNA S5、DNA dS6各1 mL （10 mmol/L PBS缓冲溶液， pH 7.4）加入到（1）中的产物溶液中，18 ℃ 下反应24 h。加入1 mL 10 μmol/L DNA S8溶液（10 mmol/L PBS缓冲溶液， pH 7.4），18 ℃ 下反应2 h，20000 r/min离心30 min，得到带Ramos细胞适体末端（DNA S8）的，可用于识别Ramos细胞的DNA纳米封装材料前体。 DNA S8本身带有绿色荧光素FAM，因此合成的DNA纳米封装材料也带有绿色荧光，在对目标细胞Ramos识别的过程中与Ramos细胞特异性结合， 而从DNA纳米封装材料上脱落，使得目标细胞荧光染色。为了降低封装材料本身的背景荧光信号，本实验引入一条人工设计的单链DNA S9，它能与DNA S8端头（含绿色荧光素FAM的一端）部分碱基互补杂交，且其一端修饰了荧光淬灭基团BHQ。DNA S9通过杂交作用组装到DNA纳米封装材料前体结构上后，BHQ靠近FAM淬灭了其荧光，有效降低了背景荧光。 （3）向（2）中制备好的DNA纳米封装材料前体中加入过量DNA S9，和1 mL （10 mmol/L PBS缓冲溶液， pH 7.4）的DNA S7， 18 ℃ 下反应24 h， 20000 r/min下离心30 min，得到最终产物：DNA纳米封装材料。分散到200 μL PBS缓冲溶液（10 mmol/L， pH 7.4）中， 于4 ℃下避光冷藏保存。（DNA S7为辅助DNA结构，其端头修饰的巯基可以介导DNA纳米封装材料匍匐式地结合到金纳米笼表面，从而形成牢靠的DNA密封结构，防止药物泄露（设计原理见图1）。 2.4.3金纳米笼胶囊的制备取200 μL 0.1 μmol/L 盐酸阿霉素（DOX）加入1 mL 金纳米笼中，抽真空浓缩，得到DOX/Au 纳米笼溶液。将100 μL 10 mmol/L三（2甲酰乙基）膦酸盐酸（TCEP）加入1.2 mL 制备好的DNA纳米封装材料（由 10 mmol/L，pH 5.6 的醋酸缓冲溶液配置）中，反应 30 min后，加入 1.2 mL DOX/Au 纳米笼溶液，18 ℃下避光振荡反应 24 h，得到表面被DNA封装材料覆盖密封的DOX/Au纳米笼即金纳米笼胶囊溶液。在2000 r/min下离心洗涤两次，所得沉淀重分散于200 μL PBS 缓冲溶液（10 mmol/L，pH 7.4）中，终产物金纳米笼胶囊于 4 ℃ 避光保存。 2.5金纳米笼胶囊用于Ramos细胞成像 将适量制备好的金纳米笼胶囊加入到Ramos细胞中，35 ℃ 下避光孵育30 min。将 10 μL 细胞样品溶液滴在载玻片上并覆盖上盖玻片，盖玻片周围用石蜡封闭。 用 Leica TCS SP5 II 激光共聚焦显微镜观察并拍摄Ramos细胞的荧光成像图。 3结果与讨论 3.1银纳米立方体和金纳米笼的结构表征 为了了解银纳米立方体和金纳米笼的形貌，对它们分别采用了透射电子显微镜（TEM）进行表征，成像结果如图2所示。 4结论 本研究制出一种基于金纳米笼内核，DNA纳米结构密封外壳的核壳结构金纳米笼胶囊。此胶囊利用金纳米笼中空结构装载药物，利用DNA纳米结构外壳实现药物的封装及胶囊的靶向。此纳米胶囊的特点是：（1）依靠DNA纳米结构壳上预先设计的荧光开关识别系统（荧光DNA适体：DNA aptamerFAM，和与其匹配的荧光淬灭团：DNABHQ）实现对靶标细胞的特异性识别和荧光打开式标记，降低了细胞成像时的背景荧光干扰，同时也将胶囊介导到特定细胞表面；（2）利用中空金纳米笼将抗癌药物输送到细胞内部，并借由脱氧核糖核酸酶降解作用降解DNA纳米结构壳，释放药物；（3）利用激光共聚焦显微镜的多通道成像特性，结合双荧光设计（DNA aptamerFAM，药物DOX），通过双通道叠加图中各区域色彩变化情况来判断药物释放程度。本工作提出的金纳米笼胶囊与同类研究中其它载药系统如脂质体胶囊、去铁铁蛋白胶囊等相比主要具有以下优点：采用了功能化DNA纳米结构外壳设计，集成了荧光打开式识别结构，在特异性识别靶标细胞的同时，对靶标细胞进行荧光标记，且降低了背景荧光信号。金纳米笼胶囊本身能够提供荧光标记，无需对样品预染色，简化了实验操作。综上所述，本工作提出的金纳米笼胶囊是一种同时具备荧光成像探针和药物靶向投送功能的新型纳米胶囊。利用它成功实现了靶标Ramos细胞的荧光成像和药物靶向投送及药物释放情况跟踪。本研究为靶向载药系统的基础研究提供了参考。 References 1LIU XiaoGeng， XIE YaTong. 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