| 标题 | QuEChERS超高效液相色谱串联质谱法测定坚果中38种农药残留 |
| 范文 | 董亚蕾 刘文婧 曹进 王钢力 摘要建立了检测4种坚果（花生、杏仁、腰果、核桃）中38种农药残留的QuEChERS超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）方法。样品均质后，用乙腈进行提取，经PSA和C18净化后，采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱进一步净化， UPLCMS/MS分析。对样品前处理和色谱方法进行了优化。在多重反应监测（MRM）模式下进行质谱分析，外标法定量。38种农药的检出限范围（S/N=3）为0.01～10 μg/kg，定量限（S/N=10）为0.05～20 μg/kg，线性关系良好（r>0.991）。4种坚果中农药的平均加标回收率为51.0%～126.0%，相对标准偏差均小于20%。此方法灵敏、准确、有效，可用于坚果类食品中多种农药残留的同时测定。 关键词超高效液相色谱串联质谱； QuEChERS； 农药残留； 坚果 1引 言 坚果是一类营养价值很高的食物，其所富含的维生素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和微量元素等对人体生长发育、增强体质、预防疾病有极好的功效，是人们日常饮食的重要组成部分[1]。近年来，随着人们对食品安全问题的日益关注，坚果中农药残留问题也逐渐引起人们的重视[2，3]。中国[4]、美国、日本以及国际食品法典委员会（CAC）等国家或组织都对坚果中的农药残留设定了严格的最大限量标准，坚果中的农药残留分析成为食品检测中的一项重要内容。 液相色谱质谱联用技术被广泛应用于多农药残留检测[5]，国标中也多采用此方法[4]。李南等[6]采用气相色谱串联质谱法定性和定量分析坚果中185种农药残留，分析时间较长。杨巍等[7]采用高效液相色谱串联质谱法测定了坚果中62种农药残留，采用固相萃取法进行样品前处理，需要使用大量的正己烷、甲苯等有机试剂。Lin等分别采用固相萃取[8]和凝胶渗透色谱（GPC）[9]净化进行农药的样品前处理，但在多种类型农残分析方面仍存在不足。QuEChERS方法使用乙腈等溶剂提取样品，在提取液中加入合适的固体吸附剂，如PSA、C18、GCB等，达到除去基质中的干扰物和对目标组分的提取和净化目的[10]，方法快速、可靠、经济、简便，被广泛应用于水果[12，13]、蔬菜[14，15]、谷物[16]等样品中农残测定， 尤其适用于含水量较大的样品中农药的多残留分析[11]。相比之下，坚果样品中水分含量较低，油脂含量较高，易随有机提取剂萃取出来，干扰测定。Zhu等[17]采用QuEChERS和高效液相色谱串联质谱（HPLCMS/MS）测定了花生中及土壤中啶氧菌酯的代谢状况。Lopes等[18]以乙酸乙酯和乙腈混合溶剂为提取溶剂，采用改进的QuEChERS方法和超高效液相色谱串联质谱 （UHPLCMS/MS）分析了花生中113种农残。除此之外，QuEChERS法还可用于植物油中农残的前处理[19，20]。以上研究结果说明，QuEChERS在富含油脂类样品的前处理方面具有一定的应用潜力。对基于QuEChERS的样品前处理过程改进，并采用UPLCMS/MS测定多种坚果样品中的多种农药残留，仍需要进一步的研究。 花生，杏仁、腰果和核桃是我国居民经常食用的坚果。本研究选用UHPLCMS/MS法检测坚果中的农药残留。样品采用QuEChERS方法处理，用Oasis PRiME HLB小柱进一步净化。将本方法尝试用于这4种坚果中农药多残留的分析，结果令人满意。 2实验部分 2.1仪器与试剂 ACQUITY超高效液相色谱Xevo TQS三重四极杆质谱仪（美国Waters公司）； CF 16RXⅡ离心机（日本HITCHI公司）； XHFD高速分散器（宁波新芝生物科技股份有限公司）； MiliQ Advangtage A10 纯水仪（美国Millipore公司）； MGS2200氮吹仪（东京理化公司）。 38种农药标准品溶液（10 μg/mL，北京振翔科技有限公司）； 甲醇、乙腈、乙酸（质谱纯，Thermo Fisher公司）； 甲酸（质谱纯，美国Fluka公司）； 实验用水为超纯水（符合GB/T 66822008一级水要求）； QuEChERS净化包（含PSA、C18和MgSO4）和盐包（MgSO4和乙酸钠）、Oasis PRiME HLB 固相萃取柱（美国Waters公司）。花生、杏仁、腰果和核桃4种坚果样品均购自本地超市。 2.2样品前处理 市售坚果样品随机选用适量，用高速分散器磨碎后置于 Symbolm@@ 20℃保存。称取5.0 g均质样品于50 mL具塞离心管中，分别加入7.5 mL冰水/10 mL冰乙腈，涡旋提取1 min。再分别加入盐包（含1.5 g乙酸钠和6 g MgSO4），剧烈振摇1 min后， 10000 r/min离心5 min。取上层乙腈层和油脂层，加入到预先加有净化包（500 mg PSA、500 mg C18和1500 mg无水MgSO4）的15 mL离心管中，涡旋30 s，10000 r/min离心8 min。取上清液3 mL过Oasis PRiME HLB固相萃取柱，保持每秒1滴的流速，取2 mL流出液于15 mL离心管中，在40℃水浴中氮吹近干。向其中加入1 mL流动相進行复溶，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，转移至进样小瓶，待测。 2.3标准溶液的配置 标准储备溶液：购买的38种农药标准品溶液作为储备液，溶剂为甲醇，浓度均为10 μg/mL，4℃避光保存。 基质标准溶液的配制：样品按照2.2节条件进行前处理后进行仪器分析，当38种农药的定性与定量离子信噪比均小于3时，样品确定为空白基质。空白基质按照2.2节条件前处理，获得空白基质提取液。分别平行移取8份空白基质提取液2 mL于15 mL离心管中，在40℃水浴中氮吹近干。分别加入1 mL浓度为0.5、1、2、5、10、20、50和100 μg/L的混合对照溶液（10 μg/mL混合标准储备液用10%（V/V）甲醇水混合溶液稀释即得），配制成相应浓度的基质匹配对照溶液（现用现配），0.22 μm微孔膜过滤，待分析。 2.4液相色谱串联质谱条件 2.4.1液相色谱条件ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm）； 柱温：35℃； 进样体积：5 μL； 进样器温度：4℃； 流动相A：0.1%（V/V）甲酸水溶液，流动相B：0.1%（V/V）甲酸甲醇溶液； 流速：0.3 mL/min； 梯度洗脱程序：0～0.25 min，10% B； 0.25～20 min，10%～100% B； 20～23min，100% B； 23～23.01 min，100%～10% B； 23.01～26 min，10% B。弱洗针溶液：10%甲醇90%水溶液； 强洗针溶液：80%甲醇20%水溶液，用于清洗进样针的外壁，避免残留。 2.4.2质谱条件离子化模式： ESI+； 毛细管电压：3 kV； 扫描模式：多反应监测（MRM）模式； 去溶剂气：氮气，400℃，800 L/h； 锥孔气：氮气，5 L/h。38种农药化合物的详细质谱参数见表1。 3结果与讨论 3.1液相色谱条件的优化 3.1.1流动相的选择考察了甲醇水、甲醇（0.1%甲酸）水（0.1%甲酸）、乙腈（0.1%甲酸）水（0.1%甲酸）、甲醇（10 mmol/L乙酸铵）水（10 mmol/L乙酸铵）和乙腈（10 mmol/L乙酸铵）水（10 mmol/L乙酸铵）5种流动相在相同梯度洗脱条件下，对38种农药化合物的分离度、灵敏度和峰型的影响。结果表明，乙酸铵的引入造成抑霉唑和水胺硫磷两种化合物不出峰。因此选用甲酸作为流动相改性剂。在甲酸浓度为0.1%时，比较了甲醇水和乙腈水两种流动相体系。相同洗脱梯度下，甲醇水具有更好的分离效果。因此，选用甲醇水（0.1%甲酸， V/V）为流动相。 3.1.2进样溶剂的优化乙腈是常用的稀释溶液，然而本方法中混合标准溶液经乙腈稀释后，大部分峰发生前延，且峰形较差。为了使样品基质与流动相体系尽量保持一致，考虑到流动相为甲醇水（0.1%甲酸）体系，分别考察了50%（V/V）甲醇水和10%（V/V）甲醇水混合溶液的稀释效果。采用50%甲醇水混合溶液为进样溶剂时，前3 min内的峰均较宽。出峰时间为1.5 min处的峰为吡蚜酮的峰，发生展宽且严重裂分。而10%甲醇水溶液作为进样溶剂则能获得较好的结果。因此，实验采用10%甲醇水作为进样溶剂。为保持体系性质的一致性，实验过程中，样品经乙腈提取，提取液经净化和氮气吹干后，也采用10%甲醇水混合溶液复溶。 3.2质谱条件的优化 以甲醇水（0.1%甲酸， V/V）作为流动相，在正离子模式下，对38种农药化合物的标准溶液（100 μg/L）进行全扫描，38种化合物均能获得稳定的母离子。然后以SIM扫描模式优化Cone值； 再进行子离子扫描，每种化合物选择2个响应值高的子离子作为定量和定性离子，进一步优化碰撞能。最后在多反应监测模式（MRM）下优化去溶剂气温度、流速、离子源温度等质谱参数。在最佳条件下，38种农药化合物均能进行定性与定量检测，如图1所示。 3.3前处理方法的优化 3.3.1提取溶劑的选择在农残分析中，常用的提取溶剂是乙腈，提取效率高，去除脂肪、蛋白质和糖分等杂质效果好，并且挥发性低。以添加水平为100 μg/kg的花生为研究对象，考察了纯乙腈、含1%（V/V）乙酸的乙腈、正己烷饱和的乙腈[21] 3种提取剂对38种农药的提取效果。结果表明，乙腈和酸化乙腈的提取回收率没有显著性差异。以正己烷饱和的乙腈为提取溶剂时，出峰时间较长的几种物质回收率较低，这可能是因为正己烷饱和的乙腈能提取出更多的脂溶性物质，对弱极性农药化合物的基质抑制效应明显增强。乙腈虽然不能完全溶解非极性的脂肪，但仍是一种较好的提取溶剂。因此，本实验选取乙腈作为提取溶剂。 3.3.2提取溶剂体积的确定以花生为研究对象，准确称量5.0 g样品，添加水平为100 μg/kg时，分别考察了乙腈体积为10、15和20 mL时对农药残留的提取效果。结果表明，采用10 mL乙腈能达到充分提取目标分析物的目的。 3.3.3固相萃取柱的使用与蔬菜水果等样品相比，坚果样品中油脂含量较高，最高达60%以上。仅采用QuEChERS净化后，提取液中残留的脂溶性物质及其它干扰性物质影响农药的测定。因此，样品提取液经QuEChERS净化后，再经流经固相萃取柱，以达到进一步净化的目的。以添加水平为100 μg/kg的花生为研究对象，分别检测QuEChERS处理后的溶液及经反相固相萃取柱PRiME HLB柱进一步净化的溶液。结果表明，经过PRiME HLB固相萃取柱进一步净化的提取液中，38种农药化合物的响应均有不同程度的增强。这说明固相萃取柱的使用进一步净化了提取液，降低了基质抑制作用，因此本研究采用PRiME HLB柱进一步净化。 3.4基质效应 基质效应为基质匹配校准曲线的斜率与溶剂标准校准曲线的斜率两者之比，比值越接近1，则基质效应越小[22]。详细研究了38种农药在花生、杏仁、腰果和核桃4种坚果中的基质效应，结果列于表2。从样品基质角度比较，核桃的基质效应最大。从38种农药化合物角度比较，敌百虫（Trichlorfon）和嘧霉胺（Pyrimethanil）的基质效应最为明显。为克服基质效应，常用的方法有基质匹配标准曲线法、采用性质相近或稳定同位素内标法、减小进样量等。其中，基质匹配标准曲线法不但效果良好，而且具有廉价、操作简便的特点[23]。因此本研究使用配制基质匹配标准曲线的方法降低基质效应。 3.5农药残留在样品提取液中的稳定性 采用空白基质提取液中加标的方法，考察了4种基质提取液中38种农药化合物在40 h内的稳定性。核桃中嘧菌胺和花生中的甲氧虫酰肼加标水平为25 μg/kg，其它农药加标水平为15 μg/kg时，分别测定农药化合物在第0、4、8、12、24和40 h的浓度，计算6个浓度数据的RSD，RSD<20%可认为没有发生明显降解。结果表明，在花生、杏仁、腰果的基质提取液中，38种农药在40 h内均未发生显著降解。核桃的基质提取液中，敌百虫和甲氧虫酰肼在40 h内的浓度变化明显。在初始的8 h内两种化合物较为稳定，8 h后发生明显的降解，12 h后降解率达30%～40%。因此，为保证实验数据的准确性，在实验过程中，核桃样品的提取液须在8 h内检测。 3.6方法学评价 3.6.1检出限与标准曲线在优化的分析条件下，38种农药化合物各选择一个定量离子和一个定性离子，其在花生、杏仁、腰果和核桃4种样品基质中检测的线性范围、线性相关系数、检出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）列于表3。 38种农药化合物在各自的线性范围内，线性关系良好， 线性相关系数均大于0.991，检出限和定量限分别为0.01～10 μg/kg和 0.05～20 μg/kg。 3.6.2精密度與加标回收率在花生、杏仁、腰果、核桃4种空白样品中进行38种农药化合物在3个浓度水平的加标回收率实验。考虑到花生、腰果和核桃中的甲氧虫酰肼定量限分别为20、15和15 μg/kg，核桃中啶氧菌酯和嘧菌胺的定量限分别为14和20 μg/kg，3个添加水平分别为40、60和100 μg/kg。其余化合物在4种样品基质中的定量限均不高于10 μg/kg，故其添加水平分别为20、40和60 μg/kg。每个添加水平进行6次平行实验。采用基质匹配标准曲线进行定量分析，结果列于表4。4种坚果中38种农药的平均回收率在51.0%～126.0%范围内， RSD<20%。证明此样品前处理方法及UPLCMS/MS检测方法灵敏、准确、有效，可适用于4种坚果中38种农药残留的同时测定。 3.7实际样品的分析 应用本方法测定了市售的花生、杏仁、腰果、核桃4种坚果中的农药残留。腰果和核桃样品中未检出38种农药残留。花生样品中检出吡虫啉残留，含量为2.51 μg/kg。杏仁样品中检出氯虫苯甲酰胺残留，含量为1.39 μg/kg，两者均未超过我国的最大残留限量（MRLs）标准。图2为花生和杏仁中两种农药残留的提取离子色谱图。 4结 论 本研究选择了4种代表性的高油脂坚果（花生、杏仁、腰果和核桃），建立了QuEChERS方法净化、PRiME HLB小柱进一步净化、超高效液相色谱串联质谱测定坚果中38种农药残留的检测方法。本方法简单、有效、准确，满足痕量分析要求，适用于花生、杏仁、腰果和核桃等坚果中农药残留的检测。 References 1Dietary Guideline for Chinese Residents （2016 Edition）. 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A， 2012， 1270： 235-245 Determination of 38 Kinds of Pesticide Residues in Nuts by QuEChERSUltra Performance Liquid ChromatographyTandem Mass Spectrometry DONG YaLei1， LIU WenJing1，2， CAO Jin*1， WANG GangLi1 1（National Institutes for Food and Drug Control， Beijing 100050， China） 2（China Pharmaceutical University， Nanjing 211198， China） AbstractA multiresidue analysis method was developed for the determination of 38 kinds of pesticides in nuts （almonds， peanuts， cashew nuts and walnuts） by QuEChERSultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry. The pesticide residues were extracted with acetonitrile. The extract was cleaned up with PSA， C18 and Oasis PRiME HLB， and then analyzed by UPLCMS/MS with multiple reaction monitoring （MRM） mode. External standard method was employed to quantify. The limits of detection （LODs， S/N=3） of this method were between 0.01 and 10 μg/kg， and the limits of quantitation （LOQs， S/N=10） were between 0.05-20 μg/kg. All of the tested pesticides showed good linear relationship （r>0.991）. The practical samples were determined at three spiked levels and the average recoveries were between 51.0% and 126.0%. The RSDs were less than 20%. This method was simple， sensitive and accurate， and could be used for the routine analysis of pesticide residues in nuts. KeywordsUltrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； QuEChERS； Multipesticide residues； Nuts （Received 5 December 2016； accepted 23 June 2017） This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21405159） |
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