| 标题 | 基于BHHCTEu3+@SiO2荧光稀土二氧化硅纳米颗粒的免疫层析试纸条检测卡那霉素 |
| 范文 | 赵兵洁+赵金宝+齐小花+邹明强+陈艳+张帆+杨屹 摘 要 采用微波辅助合成的荧光稀土二氧化硅纳米颗粒（BHHCTEu3+@SiO2）为标记物，建立了快速定量检测卡那霉素（Kana）残留的荧光免疫层析方法。实验结果表明，微波辅助合成的BHHCTEu3+@SiO2納米颗粒呈球形，粒径约36 nm，具有良好的荧光发射性能，最大吸收波长和最大发射波长分别为343和615 nm。将BHHCTEu3+@SiO2与卡那霉素抗体（Kanaab）通过醛基化葡聚糖交联，合成了荧光标记抗体Eu3+Kanaab，结合定量侧向层析读数仪，建立了牛奶中Kana残留的快速定量检测方法，对Kana的检出限（IC10）为0.85 ng/mL，半数抑制浓度（IC50）为12.76 ng/mL，检测范围（IC20-IC80）为3.0～76.0 ng/mL，牛奶中的Kana的加标回收率范围为93.7%～97.4%，RSD为3.1%～4.6%，与Kana类似物的交叉反应均<1%。牛奶中Kana残留的测定结果与ELISA方法相关性良好。 1 引 言 卡那霉素（Kanamycin， Kana）属于氨基糖苷类抗生素，对大肠杆菌等革兰氏阴性菌有很强的抑制和杀菌作用[1，2]，由于价格低廉且抗菌谱广，已广泛用于动物养殖中。然而，卡那霉素在动物源性食品中的过量残留会对人体产生严重的副作用，欧盟和日本等国家和地区规定牛奶中卡那霉素最大残留限量为150 μg/L[3]。 目前，用于Kana检测的方法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）[4]、高效液相色谱法[5]、液相色谱串联质谱法[6]和微生物检测法[7]等。液相色谱串联质谱法检测灵敏性高，但检测费用较高。微生物检测法测定时间长，且结果误差较大。ELISA利用抗原抗体特异性结合，具有高选择性，但不适合现场检测。因此，建立成本低、灵敏度高、选择性高且可用于食品安全现场快速检测的卡那霉素检测技术十分必要。目前，常用的现场快速检测方法为胶体金免疫试纸条法[8～10]，该方法简便快捷、费用低，但在定量检测和灵敏度方面存在不足。近年来，以稀土荧光二氧化硅纳米颗粒等荧光材料作为标记探针的荧光免疫层析技术（Lateral flow immunoassay， LFIA）[11～13]得到广泛发展，该方法能有效消除检测背景强度，提高检测灵敏度，可实现定量及多元检测。Zhang等[11]以荧光稀土二氧化硅纳米颗粒作为荧光标记探针，建立了荧光免疫层析分析方法，用于玉米细菌性枯萎病菌的检测分析，检出限比胶体金试纸条低100倍。Bian等[12]建立了一种可检测抗生素残留的荧光免疫层析方法，并与ELISA和UPLCMS/MS方法进行对比，结果表明，该方法检测结果可靠。稀土荧光二氧化硅纳米颗粒可采用掺杂[14～16]和共价交联[17，18]两种方法制备。掺杂型纳米颗粒是将稀土配合物与SiO2物理掺杂制备而成，在应用过程中存在荧光泄露的问题。通过共价交联将稀土配合物化学键合在SiO2表面形成的共价型纳米颗粒避免了荧光泄漏问题，但其制备时间较长。微波辅助合成技术具有反应效率高、反应时间短的优点，目前已用于多种纳米材料的制备[19]。 本研究基于荧光稀土二氧化硅纳米颗粒建立了快速定量检测卡那霉素残留的荧光免疫层析方法。以4，4′二（1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″七氟4″，6″己二酮6″基）氯磺酰邻三联苯（BHHCT）为配体，利用微波辅助合成法制备了BHHCTEu3+@SiO2荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，以BHHCTEu3+@SiO2作为荧光标记探针，以醛基葡聚糖作为交联剂，对卡那霉素抗体进行荧光标记，用于牛奶中卡那霉素残留的检测。利用微波辅助合成技术不但缩短了荧光纳米颗粒的制备时间，而且减少了试剂消耗。实验结果表明，制备的荧光免疫试纸条可以满足牛奶中卡那霉素残留现场快速检测的要求。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 XH100A型微波催化合成/萃取仪（北京祥鹄科技有限公司）； F4500荧光分光光度计（日本日立公司）； XYZ3050点膜仪、CM4000切条机（美国Bio Dot公司）； IS4000 PRO高灵敏多模式分子成像系统（美国柯达公司）； ESE Quant定量侧向层析读数仪（北京天根生化公司）； Sunrise酶标分析仪（奥地利Tecan公司）。 Triton X100、Tween 20、3氨丙基三甲氧基硅氧烷（APTS）、EuCl3、硼氢化钠、4，4′二（1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″七氟4″，6″己二酮6″基）氯磺酰邻三联苯（BHHCT）和N（3二甲氨基丙基）N'乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）均购自SigmaAldrich公司； 卡那霉素单克隆抗体（Kanaab）由中国检验检疫科学研究院提供； 牛血清白蛋白（BSA）和Na2Fe（CN）5NO（国药集团化学试剂有限公司）； 硝酸纤维素膜（NC膜）（M135，美国Millipore公司； PV90，美国PALL Vivid公司； AE99，英国Whatman公司）； 葡聚糖Dextran（Mw 500000， 美国AcrosOrganics公司）； 羊抗鼠二抗IgG（中国武汉博士德生物工程有限公司）； 卡那霉素（百灵威公司）； 丙酮（美国J.T.Baker公司）； 三羟甲基氨基甲烷（Tris， 美国NOVON公司）； 其它试剂均为分析纯； 实验用水为超纯水。 2.2 BHHCTEu3+@SiO2的制备 首先用微乳液法合成SiO2纳米微乳液[20]，再加入3 μL APTS，采用微波催化合成/萃取仪加热，微波功率700 W，温度70℃，反应时间20 min，得到表面氨基化的SiO2纳米颗粒。将BHHCTEu3+稀土荧光配合物（由2.5 mg BHHCT与4.84 μL 0.64 mol/L EuCl3避光反应3 h制得）加入到上述微乳体系中，采用微波催化合成/萃取仪加热，微波功率700 W，温度59℃，反应时间20 min（图1A）。利用水浴加热（NonMicrowave）方法取代微波辅助合成技术，合成BHHCTEu3+@SiO2，考察荧光强度，计算量子产率。 2.3 包被抗原KanaBSA的制备 将3 mL 10 mg/mL BSA与1.5 mL 90 mg/mL Kana 混合，以1 d/3 s速度滴入3 mL 300 mg/mL EDC，搅拌反应2 h，4℃避光反应过夜，用10 mmol/L PBS （pH 7.4）溶液透析。 2.4 荧光标记卡那霉素抗体（Eu3+Kanaab）的制备 以醛基化葡聚糖作为交联试剂，以BHHCTEu3+@SiO2作为荧光标记探针，对Kanaab进行荧光标记[11] （图1B）。将葡聚糖用30 mol/L高碘酸钠氧化为醛基化葡聚糖，与悬浮于25 mmol/L碳酸盐缓冲液（CBS， pH 9.6）中的4 mg BHHCTEu3+@SiO2荧光纳米颗粒避光反应7 h，醛基化葡聚糖中的醛基可与BHHCTEu3+@SiO2表面氨基生成希夫碱。用25 mmol/L CBS （pH 9.6）洗涤3次，重悬于200 μL CBS中。再加入200 μL Kanaab，4℃反应过夜，随后加入NaBH4，终浓度为5 mmol/L，4℃反应4 h，再加入50 mmol/L TrisHCl（含 2% BSA，4% 蔗糖， pH 7.8）封闭液封闭12h。最后用50 mmol/L TrisHCl （pH 7.8）洗涤Eu3+Kanaab颗粒3次，重悬于100 μL 50 mmol/L TrisHCl（0.9% NaCl，0.2% BSA，0.05% Tween 20，0.1% NaN3， pH 7.8）。 2.5 免疫层析试纸条检测方法 如图1C所示，试纸条包括衬板、NC膜、吸水纸、样品垫和抗体结合垫五部分。在NC膜上喷涂羊抗鼠二抗作为质控线（C线），喷涂KanaBSA作为检测线（T线），用10 mmol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.8）将Eu3+Kanaab稀释至一定浓度，将抗体结合垫浸入其中，取出烘干，组装试纸条。在试纸条的样品垫上滴加150 μL待测样品，在室温下避光反应30 min后，通过荧光读数仪测定T线和C线上荧光响应值（图2），以实现定量检测。阳性结果呈现两条亮线（C线和T线），而阴性结果只见到C线处一条亮线。 2.6 方法学考察 2.6.1 卡那霉素荧光免疫层析方法（LFIA） 利用试纸条对不同浓度的Kana（0～400 ng/mL）标准溶液进行检测，用荧光读数仪测定T线荧光信号值（见图2）。 空白溶液的荧光信号强度值为A0，不同浓度溶液的荧光信号强度值为A，以A/A0为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.6.2 卡那霉素ELISA分析方法[21] 用酶标仪测定不同浓度的Kana（0～100 ng/mL）标准溶液的紫外吸收信号值，以空白溶液测得的信号强度值为A0值，不同浓度标准品的信号强度为A，以A/A0为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2.7 样品分析 将某品牌纯牛奶样品离心脱脂，然后用Na2Fe（CN）5NOZnSO4沉淀蛋白[22]，离心取上清液，用200 mmol/L pH 8.0 TrisHCl展开剂稀释10倍，用免疫层析试纸条进行测定。 3 结果与讨论 3.1 透射电镜表征 透射电镜（TEM）图如图3所示，合成的SiO2和BHHCTEu3+@SiO2粒子呈均匀球形。SiO2粒子表面光滑，粒径约30 nm（图3A）； BHHCTEu3+@SiO2（图3B）表面有成簇的黑色凸起[23，24]，表明BHHCTEu3+已共价结合在SiO2表面，同时该纳米颗粒保持良好的球形形貌，粒径分布均匀，平均粒径约36 nm。 3.2 BHHCTEu3+@SiO2的荧光性质 在其它合成条件相同的情况下，对比了微波辅助合成法和水浴加热法合成的BHHCTEu3+@SiO2的荧光性能。由图4可见，两种方法合成的荧光纳米颗粒的发射光谱图并未出现显著改变。传统水浴加热法合成的BHHCTEu3+@SiO2纳米颗粒发射光谱强度为1305，微波辅助合成的纳米颗粒发射光谱强度为1775，后者荧光强度提高了36%。经计算[18]， 微波辅助合成的BHHCTEu3+@SiO2的量子产率为64.94%，明显高于水浴加热法（47.75%）。与文献[24]报道的共价型稀土荧光二氧化硅对比，虽然本研究利用微波辅助合成的稀土荧光二氧化硅纳米颗粒的荧光强度略低，但仍能满足作为生物标记物的要求。同时反应时间从5 h/5 h缩短至20 min/20 min，且BHHCT与Eu3+用量明显减少，所获得的纳米颗粒产品的量明显增多（表1）。上述结果表明，微波辅助合成技术可以大大缩短BHHCTEu3+@SiO2荧光纳米颗粒的合成时间，提高荧光信号强度。 3.3 Kana残留检测荧光试纸条的制备 3.3.1 NC膜的选择 选择3种型号（M135，PV90和AE99）硝酸纤维素膜（NC膜）进行了两次平行实验。结果表明，使用AE99的试纸条，在满足条带明显的前提下，背景干扰较少。因此后续实验采用AE99的硝酸纤维素膜。 3.3.2 层析展开剂的选择 以 200 mmol/L TrisHCl（含0.2% BSA，0.9% NaCl，pH 8.0）为母液，加入不同种类的表面活性剂，考察了5种展开剂的层析效果。依据条线清晰、明亮、无拖尾、无晕染的原则，选择200 mmol/L TrisHCl（含0.2% BSA，0.9% NaCl，pH 8.0）缓冲液中加入1% Tween20为展开剂。 3.3.3 Eu3+Kanaab浓度的选择 将Eu3+Kanaab溶液倍比稀释1∶1000，1∶1500，1∶2000，1∶4000，进行免疫层析分析。凝胶电泳成像图（图5A1）显示，随着稀释比的增加，C线和T线亮度逐渐变浅，在荧光试纸条制作过程中，T线与C线荧光强度比接近1为最佳，如图5A2所示，故选择Eu3+Kanaab稀释1500倍为最佳工作浓度。 3.3.4 检测线KanaBSA喷涂浓度的选择 将浓度分别为0.50、0.75、1.00和1.57 mg/mL的KanaBSA喷涂于NC膜上，进行检测。凝胶电泳成像仪图（图5B1）显示，随着KanaBSA浓度的增加，C线亮度逐渐减弱，同时T线亮度逐渐增强。当KanaBSA浓度为0.75 mg/mL时，C线和T线亮度适中，如图5B2所示，故选择KanaBSA浓度0.75 mg/mL为最佳工作浓度。 3.3.5 质控线羊抗鼠二抗IgG喷涂浓度的选择 将浓度分别为0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的羊抗鼠二抗IgG喷涂于NC膜上，进行检测。凝胶电泳成像图（图5C1））显示，随着IgG浓度的减少，C线亮度逐渐减弱，当IgG浓度为1.0 mg/mL时，C线和T线亮度适中，如图5C2所示，因此选择1.0 mg/mL IgG 为最佳工作浓度。 3.4 荧光免疫试纸条检测Kana残留 3.4.1 特异性及方法学考察 分别采用试纸条检测不同梯度浓度的卡那霉素、庆大霉素（Gent）、安普霉素（Apra）、妥布霉素（Tobr）和阿米卡霉素（Amik），用荧光读数仪读数，计算半数抑制浓度（IC50），抑制曲线如图6所示，根据公式计算交叉反應率（CR）： CR（%）= （IC50（Kana）/IC50（其它））×100%（1） 实验和计算结果表明，其它干扰物的交叉反应率均小于1%，表明此试纸条特异性良好。 3.5 牛奶样品分析 采用牛奶样品加标回收实验考察本方法准确度和精密度，由表2可见，Kana在牛奶样品中的添加回收率为93.7%～97.4%，RSD为3.1%～4.6%，说明本研究建立的LFIA方法可用于实际牛奶样品中Kana残留的检测，实用性良好。 4 结 论 采用微波辅助合成技术制备了共价型Eu3+BHHCT@SiO2荧光稀土二氧化硅纳米颗粒，制备时间短，颗粒呈均匀球形，荧光强度高。以制备的Eu3+BHHCT@SiO2为荧光标记探针，以醛基葡聚糖为交联剂，对Kanaab进行荧光标记，用于荧光免疫层析试纸条检测分析。结果表明，本研究建立的LFIA方法可靠，且检测时间短，操作简便，可用于牛奶中卡那霉素残留的现场快速检测。 |
| 随便看 |
|
科学优质学术资源、百科知识分享平台，免费提供知识科普、生活经验分享、中外学术论文、各类范文、学术文献、教学资料、学术期刊、会议、报纸、杂志、工具书等各类资源检索、在线阅读和软件app下载服务。