| 标题 | 基于末端脱氧核苷酸转移酶扩增DNA铜纳米簇荧光传感检测L组氨酸 |
| 范文 | 肖慧+何婧琳+肖昊+杨婵+冯泽猛+印遇龙+曹忠 摘 要 利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）扩增形成聚胸腺嘧啶（T）DNA模板，制备了聚T铜纳米簇（TSCuNCs），构建了一种用于L组氨酸（LHis）检测的荧光传感分析新方法。TdT酶在dTTP存在下合成聚T单链DNA核苷酸序列。由于胸腺嘧啶和Cu2+之间的亲合力，聚T单链DNA作为合成铜纳米簇（CuNCs）的模板，加入还原剂后形成CuNCs，荧光强度增强。在LHis存在下，L组氨酸的咪唑基与Cu2+螯合形成LHisCu2+配合物，因而进入聚胸腺嘧啶序列中的Cu2+量减少，使得合成的CuNCs数量减少，导致荧光信号减弱。实验结果表明，体系荧光响应信号与LHis浓度的对数值在5.0×10mol/L范围内呈线性关系，检出限达到3.4×10 mol/L。本方法用于实际尿液样品中L组氨酸检测的回收率为97.4%～104.6%，在生物医学及临床诊断中具有潜在应用价值。 1 引 言 L组氨酸（LHis）作为神经调节剂或神经递质控制金属元素的运输，其持续性缺乏常伴随着弗里德里希共济失调、癫痫、帕金森病和红细胞生成发育不正常[1]。LHis过量也会导致AIDS、慢性肾脏疾病[6]、阿尔茨海默病和癌症等[2]。因此，构建灵敏、高效检测LHis的方法对临床医学有重要意义。 目前，检测LHis的方法主要有比色法[3]、分光光度法[4]、液相色谱法[5]、毛细管电泳法[6]、质谱法[7]、拉曼光谱法[8]等，这些方法大多存在干扰因素多、操作复杂、分析成本高等不足。近年来，LHis荧光传感器由于高效、灵敏等优点引起广泛关注[3]，主要的测定原理： 一是核酶切割法，如Kong等[9]采用酶催化循环切割扩增单分子DNA实现对LHis的检测，样品用量少； He等[10]构建酶级联指数扩增传感平台检测LHis，选择性好； 二是量子点恢复法，Hou等[11]基于碳量子点Hg（II）体系荧光恢复策略，LHis检出限为0.15 μmol/L； 三是金属纳米簇法，Gong等[12]提出银纳米簇（AgNCs）免标记催化和分子信标扩增传感策略，LHis检出限为17 μmol/L，但所合成AgNCs成本较高，操作条件较苛刻。 2.2 L组氨酸与Cu2+的作用 用0.01 mol/L MOPS缓冲液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）配制5.0×10 mol/L LHis储备液，逐级稀释至5.0×10 2.3 TdT酶扩增聚T单链DNA （TS）模板的制备 用0.01 mol/L MOPS配制1.0×10mol/L引物链P1储备液，于4℃保存。在10 μL 1×TdT酶缓冲液中，依次加入5 μL 2 μmol/L P1，0.2 μL 100 mmol/L dTTP和4 U TdT酶， 37℃孵育2 h，然后加热至75℃保持10 min，冷卻至室温，形成混合溶液B。 2.4 TSCuNCs的制备与荧光检测 取上述溶液B，加入3.0×10mol/L抗坏血酸钠，充分反应5 min后，置于F7000光谱仪中检测荧光。激发波长为340 nm，发射波长为600 nm，激发和发射狭缝均为10.0 nm。 2.5 L组氨酸的检测 将上述CuSO4与一系列不同浓度LHis结合的溶液A与溶液B混合，加入2.0×103 mol/L抗坏血酸钠，充分反应5 min后检测荧光强度。 3 结果与讨论 3.1 检测原理 如图1所示，LHis的咪唑基与Cu2+反应，形成2∶1稳定螯合物。TdT酶在dTTP存在下扩增引物链P1形成聚T单链DNA核苷酸序列（TS），加入Cu2+时，由于T碱基和Cu2+之间存在亲合力，以聚T序列作为合成CuNCs的模板，加入抗坏血酸钠还原Cu2+，形成大量CuNCs，产生强荧光信号。加入LHis形成LHisCu2+配合物时，进入聚T单链DNA结构中的Cu2+量少，合成的CuNCs含量少，荧光信号弱。 3.2 TdT酶扩增DNA模板CuNCs各组分荧光光谱 为考察上述竞争反应，测定了体系P1、Cu2+/LHis混合物、P1/Cu2+/LHis混合物、TS、TS/Cu2+混合物、TSCuNCs存在和不存在LHis的荧光光谱图。如图2所示，前5种体系均无荧光报告基团，不产生荧光信号（曲线a， b， c， d， e）； 曲线f有强荧光信号，因为在空白实验中，Cu2+无消耗，形成大量CuNCs，得到强荧光信号。当有LHis存在时，荧光信号显著降低（曲线g），这是因为Cu2+先与LHis螯合，剩余的Cu2+再与聚T序列作用，还原成CuNCs的量少，所以荧光信号弱。因此， 基于竞争反应原理检测LHis是可行的。 3.3 条件优化 3.3.1 酶反应引物序列的选择 由于引物链（P1、P2、P3）序列不同，其二级结构会影响后续荧光信号输出，为得到最佳引物序列，将P1、P2、P3作为TdT酶底物链合成CuNCs，并考察LHis对其荧光的影响程度，如图3A所示。不存在LHis时，其荧光强度因DNA序列的不同而不同，P1最高， P3最低。其中，P1的3′GGACATA是多种碱基序列，加入TdT酶之后，在P1 3′端聚合形成聚T长链，由于T碱基与Cu2+的亲和作用合成CuNCs而发射较强荧光； 而P2的3′AAAAAAA是单一A碱基序列，能够与TdT酶聚合产物中的聚T结构互补配对，形成部分双链结构，导致CuNCs合成减少，荧光强度下降； P3为P1+P2序列长链，其5′TTTTTTT和3′AAAAAAA可以互相杂交而形成分子内部分双链结构，二级结构较复杂，在溶液中很难以单链状态存在，导致TdT酶聚合效率不高，CuNCs合成很少，荧光信号很弱。加入LHis之后，荧光信号均显著降低，这是因为LHis与Cu2+发生配位反应，难以合成CuNCs。因此，选择信背比最佳的P1作为后续实验的引物链。 同时，选择化学合成的T5（5′（T）53′）、T10（5′（T）103′）、T20（5′（T）203′）、T30（5′（T）303′）和T40（5′（T）403′），考察T5、T10、T20、T30和T40直接合成CuNCs（图3B虚线）和以它们作为引物经过TdT酶扩增后合成CuNCs（图3B实线）得到的荧光发射光谱图。结果表明， 采用TdT酶扩增DNA引物产生含有polyT的DNA比直接使用化学合成polyT引物DNA合成铜簇的荧光更强，效果更好。 3.3.2 酶孵育时间优化 由于TdT酶催化DNA扩增是一个逐步增加T碱基的过程，延伸产物链长依赖于扩增反应时间。考察了酶孵育时间对延伸长度的影响。引物链P1加入TdT酶孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，在2.0 h前，P1在TdT酶作用下迅速聚合，荧光强度逐步增加； 2.0 h后，荧光信号趋于稳定，TdT酶效率显著下降。因此，选择最佳酶孵育时间为2.0 h。 3.3.3 Cu2+浓度优化 为了高效检测LHis，找到最佳信号输出时的Cu2+浓度，考察了Cu2+浓度对传感体系荧光信号的影响。无LHis存在时，Cu2+浓度在1.5×10mol/L范围内， 体系荧光强度呈上升趋势，之后趋于稳定。加入LHis （5.0×10 3.3.4 抗坏血酸钠浓度优化 考察了系列抗坏血酸钠浓度对传感体系荧光响应信号的影响。结果表明，无论LHis是否存在，抗坏血酸钠浓度在5.0×10mol/L范围内，荧光强度均随抗坏血酸钠浓度的增加而迅速上升，这是因为随着抗坏血酸钠浓度增加，被还原的Cu0增加，合成的CuNCs增加，导致荧光增强； 抗坏血酸钠浓度达到1.0×10 mol/L后，反应达到平衡，荧光信号趋于稳定。因此，抗坏血酸钠的最佳浓度为1.0×10 3.4 分析性能测试 考察了TdT酶扩增TSCuNCs传感体系在系列LHis浓度下的荧光发射光谱。如图4A所示，传感体系的荧光强度随LHis浓度的上升而依次递减，在5.0×10mol/L； （B） Calibration curve of fluorescence intensity of the proposed sensors vs. the logarithm value of LHis concentration 3.5 方法的选择性 为了考察此传感体系对LHis的特异性识别性能，对生物体中普遍存在的多种氨基酸进行测试，如： L丝氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天门冬氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸、L赖氨酸。LHis的浓度为4.0×100.07之间。可见，当其它氨基酸的浓度为LHis浓度的5倍时，不会影响该传感体系性能。这表明其它氨基酸存在时，对体系荧光强度的干扰很小，即传感体系对LHis有特异性识别能力。 3.6 回收率 为了验证TdT酶扩增TSCuNCs传感体系检测LHis的实用性，对未经处理的成人晨尿样进行分析研究。在优化实验条件下，用0.01 mol/L MOPS缓冲液（含0.05 mol/L NaCl，pH=7.8）将尿样稀释200倍，采用加标回收法测定样品，回收率为97.4%～104.6%（见表2）。另取2个尿样进行检测，发现呈阳性，测得LHis浓度分别为1.13 和2.29 μmol/L， 表明此传感方法对实际样品中L组氨酸的检测具有实用性。 与贵金属纳米簇相比，以双链DNA为模板合成铜纳米簇（CuNCs）的荧光方法已用于LHis的检测[13]，聚T单链DNA也可作为合成CuNCs的模板[14]，用于检测碱性磷酸酶[15]、三聚氰胺[16]和Cu2+等[17]。然而，以上DNA模板均由化学合成而来。Peng等[18]利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）生物合成聚T单链DNA，以此为模板合成CuNCs，用于检测相关酶活性，与化学合成CuNCs的方法相比，该方法具有更高的荧光响应信号。文献[19，20]构建了一系列基于TdT酶扩增的荧光方法检测不同目标物，但以聚T单链DNA为模板合成CuNCs用于LHis的检测鲜有报道。因此，本研究基于DNA中胸腺嘧啶和LHis对Cu2+的竞争反应，构建一种基于TdT酶扩增聚T单链DNA铜纳米簇荧光方法，实现了对LHis无标记高灵敏检测。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 F7000荧光分光光度计（日本日立公司）； PHSJ3F電位计（上海雷磁仪器厂）； BXM30R立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）； 恒温金属浴（杭州博日科技有限公司）； KQ3200B超声波清洗器（昆山超声仪器公司）。 DNA和dTTP（上海生工生物工程股份有限公司）； P1 5′端聚T，P2 3′端聚A，P3含有P1和P2序列（见表1）； TdT酶 （20 U/μL）、5×TdT酶缓冲液（美国Fermentas公司）； 3（N吗啉基）丙磺酸（MOPS）、L组氨酸、抗坏血酸钠 （美国SigmaAldrich公司）； CuSO4、NaOH、NaCl（国药集团化学试剂有限公司）； L丝氨酸、L酪氨酸、L脯氨酸、L天门冬氨酸、L亮氨酸、L异亮氨酸、L赖氨酸（阿拉丁试剂有限公司）。所用试剂均为分析纯。实验用水均为超纯水（电阻率≥18.25 MΩ·cm）。 |
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