| 标题 | 金属/基质增强飞行时间二次离子质谱用于单细胞脂质分析 |
| 范文 | 李好问+华鑫 龙亿涛 摘要单细胞中化学成分的分析对细胞生长、信号转导、凋亡等生理过程意义重大。飞行时间二次离子质谱（SIMS）是一种高灵敏的表面质谱成像技术，具有较高的空间分辨率，已被用于细胞及微区域分析。然而，生物有机分子较低的离子化效率限制了oSIMS在单细胞分析中的广泛应用。本研究采用金属/基质增强方法，明显提高了脂质的离子化产率。镀金硅片上磷脂酰胆碱PC （0：0）标样在加入基质后，准分子离子峰强度增大为硅片上的65倍。相应基底上单细胞表面脂质信号同时增强，但由于细胞的不规则形貌以及复杂化学环境影响，脂质信号增强幅度较小。在此基础上，使用延时提取（Delayed extraction， DE）模式克服了细胞形貌带来的影响，进一步增强脂质信号，并获得了高质量的单细胞脂质成像图。此方法为研究细胞代谢及细胞环境相互作用提供了新的途径。 关键词单细胞分析； 脂质； 飞行时间二次离子质谱； 金属/基质增强； 质谱成像 1引 言 单个细胞在结构、组成及代谢等方面存在差异，这种差异带来的影响在组织、器官等的功能上均有所体现。针对多个细胞的常规分析方法测得的结果通常无法保留这些个体差异信息，难以准确评估及预测细胞的生理学行为，因此，单细胞分析引起越来越多的关注[1]。单细胞分析的一个重要内容是单细胞脂质分析。脂质代谢是细胞代谢的一部分，在外界环境刺激下，细胞代谢途径将发生改变，同时诱导脂质组分发生改变，例如丙肝病毒侵染细胞后，改变了胆固醇代谢，使得细胞内胆固醇代谢物链甾醇增多[2， 3]； 人体乳腺组织为了应对微环境的改变，其脂肪酸、磷脂酰肌醇等组成成分增加[]； 用谷物喂养的小鼠其脑部组织中胆固醇含量大大下降[5]。由此可见，脂质与细胞代谢过程密切相关，单细胞脂质分析对于理解细胞代谢过程具有重要意义。 单个细胞具有较小的尺寸（微米级）和极低的分析物量，这就要求单细胞分析手段具有极高的灵敏度及空间分辨率，因此，单细胞分析是一个大的挑战[6]。单细胞成像是单细胞分析最重要的领域之一，目前用于单细胞成像的技术主要包括光学显微镜[7，8] 、电子显微镜[9]、扫描探针显微镜[10]及质谱成像[11，12]等，这些技术为单细胞分析提供了丰富的结构、形貌及组分空间分布等信息[13，1]。质谱成像是一种非标记的化学成像方法，可以同时对多种成分进行成像分析[15，16]。目前的质谱成像技术主要包括基质辅助激光解吸电离质谱（MALDIoMS）[17]、解吸附电喷雾质谱（DESIMS）[18]及二次离子质谱（SIMS）[19]。MALDIoMS常用于组织成像，然而其空間分辨率仍难以满足单细胞分析的需求，目前报道的最高横向分辨率为5 μm[20]。SIMS在质谱成像中具有最高的空间分辨率，其横向分辨率可达100 nm以下，适用于单细胞成像。飞行时间二次离子质谱（oSIMS）使用飞行时间检测器，具有较高质量分辨率。目前oSIMS用于单细胞分析已有报道[21～23]，但其对于生物分子较低的离子化产率一直是限制其应用的主要问题之一。为了提高二次离子化产率，主要从新型离子源[2]、激光辅助置后电离[25]以及基质增强[26]等方面展开研究。本研究利用MALDIoMS中常用的基质材料2，5二羟基苯甲酸（DB）和贵金属基底增强脂质分子在oSIMS检测中的离子化产率，并进一步优化仪器参数，以期获得高质量的单细胞成像结果。 2实验部分 21仪器与试剂 Denton电子束蒸发设备（美国Denton公司）； Petroff细胞计数器（美国ausser公司）； 冷冻干燥机（北京四环公司）； 飞行时间二次离子质谱（oSIMS，德国IONO公司）。 醋酸铵、丙酮、乙醇、2O2及2SO（分析纯，上海凌峰化学试剂公司）； 磷脂酰胆碱（PC （0：0）， 美国Avanti Polar Lipids公司）； 人乳腺癌MC7细胞（南京凯基生物公司）； 2，5二羟基苯甲酸（DB）、10% 胎牛血清（SigmaAldrich公司）； 其它试剂均为分析纯。实验用水由MilliQ超纯水系统（美国Millipore公司）制备。硅片（1 cm×1 cm， 北京中镜科仪有限公司）。 22实验方法 221样品前处理硅片依次在丙酮、乙醇和水中超声30 min，用去离子水吹洗后，氮气吹干，然后用电子束蒸发仪先镀3 nm钛，再镀30 nm金。洗干净的硅片及镀金膜的硅片在Piranha洗液（2SO2O2，3∶1， V/V）中清洗30 s除去表面有机物，再用去离子水冲洗，氮气吹干。磷脂PC （0∶0）加正癸烷溶解， 配制成2 mmol/L的溶液，并用水稀释至50 μmol/L。 222细胞培养人乳腺癌MC7细胞接种于Piranha洗液清洗后的硅片或金片，并使用RPMI160培养基（美国GIBCO公司）培养，培养基中加入10% 胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素，将细胞置于37 ℃，5% CO2环境中培养2 h。细胞密度由细胞计数器测得。 23样品制备 培养结束后将基片取出，置于150 mmol/L 醋酸铵溶液（p 7）中清洗30 s，以去除细胞表面残留的盐，使用Kimwipe无尘纸将金片边缘的水吸干，在细胞上方滴加10 μL 01 mg/mL DB溶液，立即转入液氮中进行快速冷冻，然后冷冻干燥。 分别在硅片和镀金硅片上滴加2 μL上述磷脂PC（0：0）溶液，然后在其中一片镀金硅片的磷脂溶液中加入05 μL 001 mg/mL DB溶液，待基片上溶液变干。 2oSIMS仪器参数 oSIMS质谱及成像通过使用30 keV Bi+3 LMIG，Bi+3离子束束流05 pA，分析区域为60 μm × 60 μm，横向分辨率为200 nm，256×256像素，周期时间130 μs，质量范围为0～1600 u。 25oSIMS數据分析 oSIMS数据由oSIMS自带软件SurfaceLab 67进行采集及分析，用于质量校正的峰为： C+， C2+3及C3+3。 3结果与讨论 31不同基底对oSIMS脂质离子化效率的影响 常规oSIMS通常被认为是“硬电离”技术，易造成解离分子的严重碎片化而难以得到完整的分子离子峰[27]。近年来，簇状一次离子源，例如Bi+n、 Au+n、 C+60、Ar+n和（2O）+n等的引入大大减少了对分子的破坏，提高了分子的离子化效率，使得oSIMS得以较多地应用于生物小分子的研究[28～30]。然而，由于基质效应，处于细胞中的生物分子离子化效率仍然较低，难以满足细胞代谢的研究需求。为了研究基底材料对脂质分子离子化效率的影响，分别测试了硅片、镀金硅片及加基质（DB）的镀金硅片上磷脂PC （0∶0） 的oSIMS质谱图（图1）。结果表明，硅片上PC （0∶0） 准分子离子峰（m/z 8668， [M+]+）信号很弱，信噪比低，而在镀金硅片上准分子离子峰强度增大为硅片上的20倍，信噪比明显提高，加入基质DB后，分子离子峰信号增大为硅片上的65倍。结果表明，镀金基底对于磷脂PC （0∶0） 分子的离子化具有明显的增强作用，在加入基质DB后，其离子化效率得到进一步的提升，这是因为脂质容易获得氢质子从而正离子化，而2，5二羟基苯甲酸易解离出氢质子，而氢质子供给脂质以及脂质碎片，使得脂质及脂质碎片二次离子产率提高，因此可以提高脂质的信号强度。 32基底及仪器模式对单细胞表面脂质离子化效率的影响 单细胞尺寸虽小，但其组成极为复杂，在单细胞oSIMS检测中，复杂的化学环境对于细胞成分的离子化效率具有强烈的抑制作用，即所谓“基质效应”[31]。选择合适的细胞培养基底有助于减轻基质效应，对于oSIMS单细胞成分检测具有重要作用。另外，oSIMS成像中一个技术问题是难以同时获得高质量分辨率和高空间分辨率，这是由于在常规oSIMS仪器中难以同时获得高离子束流和好的离子束聚焦。“延时提取”（DE）模式是一种飞行时间激光解吸附电离质谱技术中的常用模式，近年来也在oSIMS中有所应用，基本原理是使长脉冲一次离子束轰击样品表面获得的二次离子在样品上方停留一段时间后再进入检测器，在保证成像质量的基础上提高质量分辨率[32]。实验对比了常规“快速成像”（ast imaging，I）模式与DE模式对单个乳腺癌MC7细胞检测质谱及成像质量的影响。如图2所示，在硅片基底上，DE模式下细胞表面磷脂PC （3∶1）的准分子离子峰不仅质量分辨率较I模式有较大提高，峰强度也明显高于I模式。研究表明，DE技术有利于减少样品表面凹凸不平带来的影响[22]，使得更多来自于细胞边缘或凹陷处的信号被检测到，因此，信号强度相应增强。另外，细胞表面PC （3∶1）在镀金硅片上的信号较硅片上稍有减弱，但在加入基质DB后，信号明显增强。除了磷脂酰胆碱PC（3∶1）外，其它脂质信号也被增强，如PC（28∶0）、PC（32∶0）、PC（3∶2）、PE（3∶2）、PE（3∶1）、PE（36∶0）等。由于磷脂酰胆碱在细胞膜中含量较高，相对于其它脂质信号较强，因此本研究中以磷脂酰胆碱PC（3∶1）作为代表物进行分析。与基底上直接滴加待测物不同，细胞复杂的化学环境使得基底及基质的影响大幅减弱，相应的信号放大倍数也大幅减小。对于细胞表面其它成分（如糖类、蛋白质等），由于其离子化方式各不相同，对于可以获得氢质子从而正离子化的成分可以增强其信号，反之则不能增强。另外，oSIMS具有半定量分析的功能，对于细胞表面磷脂可以采用对多个样品进行检测，通过主成分分析可以半定量地比较细胞表面脂质成分的差异性，能够对因细胞自身状态而导致脂质组分的不同做出判断。 33单细胞表面脂质oSIMS成像研究 为研究不同基底及检测模式对于单细胞脂质成像的影响，测定了在硅片、镀金硅片及镀金硅片加基质情况下磷脂PC头基（m/z 1810）的成像图，如图3所示，并研究了I及DE模式对于成像的影响。对比图3A和3B可知，DE模式下不仅信号强度比I模式更高，也能更好地展示单细胞表面细节。与图2一致，图3C图中镀金硅片上的磷脂信号强度比硅片上稍有下降，但对于细胞细节的展现有了进一步提高。而在加入基质后的图3D图中，信号强度提高，但成像质量有所下降，这是因为表面滴加了一层基质，覆盖了部分细胞表面的细节。结果表明， DE模式比I模式能更好地展现细胞表面的细节，金基底加基质具有最好的离子化效率，但对成像质量有一定的影响，金基底上培养的细胞具有最好的成像质量。值得指出的是，为了保证足够的成像信号，每张单细胞成像图累计扫描110次，所需时间约为937 s，因此可获得较好的成像质量图。由于oSIMS高真空检测环境的限制，本方法只适用于单细胞的离线分析，尚不能进行单细胞动态实时分析。 结 论 本研究测定了在不同基底上单细胞表面脂质的oSIMS离子化效率，表明金属及基质对脂质离子化具有增强作用，与新型离子源、激光辅助后电离以及其它基质增强等方法相比，金属/基质增强的方法具有增强效果较好、无需更改现有的仪器装置、样品制备简单、不改变细胞冷冻干燥前的状态等优势。而只用金膜作为基底结合使用“延时提取”技术既能同时保留oSIMS成像的高质量分辨率与空间分辨率，还能提高表面不平整样品的成像质量，在细胞表面滴加基质2，5二羟基苯甲酸后，更进一步提高了细胞表面磷脂二次离子信号。金属/基质增强的方法主要通过将基质覆盖于细胞膜表面，以氢质子传递以及贵金属增强来提高脂质二次离子产率，而贵金属与基质没有接触到细胞内部，因此本方法对于细胞内部组分信号提高效果不明显，如果将基质覆盖细胞内部，有望进一步增强细胞内部组分信号。 本研究结果为单细胞oSIMS分析获得高质量成像图提供了有效途径，为细胞代谢、细胞药物成像等研究提供了新的方法。 References 1Klepárník K， oret Anal Chim Acta， 2013， 800： 12-21 2Costello D A， Villareal V A， Yang P L ACS Infect Dis， 2016， 2（11）： 852-862 3Villareal V A， u D， Costello D A， Xie X S， Yang P L ACS Chem Biol， 2016， 11（7）： 1827-1833 Angerer B， Magnusson Y， Landberg G， letcher S Anal Chem， 2016， 88（23）： 1196-1195 5Dowlatshahi Pour M， ennische E， Lange S， Ewing A G， Malmberg P Sci Rep， 2016， 6： 32797 6Galler K， Brautigam K， Grosse C， Popp ， Neugebauer U， Analyst， 201， 139（6）： 1237-1273 7CENG Xiaoong， ONG hiCheng， LI WangNan， Chinese Lumin， 2017， （6）： 768-779 程曉红， 钟志成， 李望南 发光学报， 2017， 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single cell analysis erein， we used metal substrate and matrix material to enhance the ionization yield of lipids he signal intensity of the phosphatidylcholine PC （0∶0） casted on the matrix/gold coated silicon substrate was 65 times higher than that on the silicon wafer Signal enhancement of phosphatidylcholine PC （3∶1） on the single cell surface cultured on matrix/gold coated silicon substrate was observed as well Due to the influence of irregular topography and complex chemical environment of cell， the increase of lipids signal was smaller Delayed extraction mode of oSIMS overcame the effects of cell topography， leading to further enhancement of the signal intensity of lipids Meanwhile， simultaneous high spatial resolution of chemical imaging and high mass resolution of the mass spectra of single cells were obtained Our strategies provided new insights into the study of cell metabolism and cellenvironment interactions KeywordsSingle cell analysis； Lipids； imeofflight secondary ion mass spectrometry； Noble metal/matrix enhancement； Mass spectrometry imaging |
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