| 标题 | 基质辅助激光解析/电离质谱用于呼吸道合胞病毒感染细胞的差异性分析 |
| 范文 | 邓文婵 摘 要 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是引起婴幼儿急性下呼吸道感染及免疫缺陷的常见病原，也是老年、 病弱群体中诱发免疫抑制的重要病原。本研究利用基质辅助激光解析/电离质谱（MALDIMS），对RSV 病毒感染宿主细胞的变化进行考察。结果表明，在分子量为5000～10000 Da范围内，有3组信号峰在正常组和感染组中表达均有显著变化，其中1个差异组分在RSV感染之后表达上调（m/z 6154.25），2个差异组分在RSV感染后表达下调（m/z 7658.47和9259.82）。本方法无需对细胞样品进行复杂处理，采用MALDIMS证明了感染细胞与未感染细胞前后表达存在显著差异，直接获得细胞在病毒感染后产生的反应应答模式和细胞生理功能改变的信息，为呼吸道合胞病毒疾病诊断与病理研究提供了实验基础。 关键词 基质辅助激光解析/电离质谱； 呼吸道合胞病毒； 疾病标志物 1 引 言 呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus，RSV）是一种RNA病毒，是引起婴幼儿急性下呼吸道感染的主要病毒病原，可引起间质性肺炎及毛细支气管炎[1，2]。其感染在全球范围都有发生，且全年均可发病，对人类健康影响较大。目前用于RSV病毒研究的主要方法有酶联免疫吸附测定[3]、 直接免疫荧光法[4]、 实时PCR技术及微阵列技术等[5]，而用质谱分析方法研究RSV病毒的报道还较少。基于蛋白组学的研究方法，建立快速识别未感染细胞与感染细胞且鉴定表达差异的有效方法，对研究RSV病毒病理和细胞生理功能改变具有重要意义。基质辅助激光解析/电离质谱（Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry，MALDIMS）作为软电离质谱的代表，具有灵敏度高、 分辨率高等优势，已在蛋白质、 多肽、 核酸等生物大分子检测尤其是蛋白质组学、 多肽组学和质谱成像分析等研究中得到广泛应用[6～10]。MALDIMS虽然在生物大分子检测方面取得了成功，但在单细胞分析方面仍然有很大的应用空间，用于病毒感染细胞前后生物分子差异表达分析方面的研究较少。 本研究采用MALDIMS，对正常细胞感染RSV病毒后的细胞组分表达差异进行分析考察。利用MALDIMS高通量、 进样量少及自动化程度高的优势，在不对细胞进行繁琐、 耗时的样品纯化等操作的前提下，初步建立了快速识别未感染细胞与病毒感染细胞的方法。相比于常规细胞样品质谱分析需要对细胞进行破碎及提取物纯化等多步繁琐操作，以及可能会造成细胞中微量样品損失等问题，本方法可实现病毒感染早期细胞的快速鉴定，可提供RSV病毒病理研究最直接的实验证据。通过对比RSV病毒感染和非感染的Hep2细胞的质谱信号变化，在排除RSV病毒自身干扰信号后，明确质谱信号是否来源于RSV病毒感染Hep2细胞，据此可实现RSV病毒感染细胞的快速鉴定， 为呼吸道合胞病毒疾病诊断与病理研究提供了实验基础。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Autoflex Speed基质辅助激光解析/电离质谱（MALDIMS，德国布鲁克公司）； CKX41光学显微镜（日本奥林巴斯公司）； 5810R高速离心机（德国艾本德公司）； CO2细胞培养箱（力康生物科技有限公司）； QL901涡旋混匀仪（其林贝尔公司）； 80℃细胞存储冰箱（美国赛默飞公司）。 RSV病毒（广州博特生物科技有限公司）； Hep2上皮细胞（中南大学湘雅医院）； 胰酶、 PBS缓冲液、 RPMI 1640培养基（Hyclone）、 胎牛血清（Gibco）、 支原体抗生素Mplasmocin（InvivoGen）、 硫酸链霉素、 青霉素G钠、 戊二醛、 中性红、 三氟乙酸、 乙腈（美国SigmaAldrich公司）； α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羟基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）（德国布鲁克公司）； 实验用水为二次蒸馏水。 2.2 实验方法 2.2.1 培养基的配制 取RPMI 1640培养基100 mL，加入10%胎牛血清、 1%双抗（青霉素G钠和硫酸链霉素）以及0.1% 抗支原体药，混合配制成10% 细胞培养基。取 RPMI 1640培养基100 mL，加入2%的胎牛血清以及1%的双抗，混合配制成2% 细胞培养基。 2.2.2 细胞的培养及病毒扩增 Hep2细胞培养在10% RPMI 1640培养基中，置于细胞培养箱中（37℃， 5% CO2）培养48 h。在光学显微镜下观察细胞生长状态，待细胞生长密度达到90%以上时，移去培养基，用5 mL PBS清洗细胞2次。然后向培养瓶内加入适量RSV病毒，置于细胞培养箱中（37℃， 5% CO2）孵育2 h，吸去RSV病毒废液，加入13 mL 2% RPMI 1640培养基，在恒温培养箱中（37℃， 5% CO2）孵育48 h。在光学显微镜下观察出现明显的合胞时，收集培养瓶中的溶液至冻存管中， 80℃保存备用。在培养瓶中加入2 mL PBS，反复冻融3次使细胞裂解，以3000 r/min离心10 min， 收集上清液，即为获得的RSV病毒，于 80℃保存备用。 2.2.3 RSV病毒毒力测定 用胰酶消化Hep2细胞，将其用2% RPMI 1640培养液配成一定浓度的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，置于恒温培养箱（37℃，5% CO2）孵育24 h。然后吸出培养液，PBS洗涤两次，加入不同浓度梯度的RSV病毒，置于恒温培养箱中（37℃，5% CO2）孵育7天。吸出培养基，PBS洗涤2次，然后每孔加入以戊二醛、 中性红和PBS配制的混合溶液100 μL，室温放置1天。吸掉废液，用清水冲洗各孔，用空斑法计算所获得病毒的毒力。 3 结果与讨论 3.1 不同基质对检测的影响 考虑到在MALDIMS分析中，基质有如下作用： 吸收并转移激光能量保护样品； 均匀分散样品避免分析物之间的缔合； 提供质子使得样品分子离子化[11]。因此， 应首先需确定合适的基质。如图1所示，分别采用α氰基4羟基肉桂酸（CHCA）、 2，5二羟基苯甲酸（DHB）、 芥子酸（SA）基质进行实验发现，CHCA基质用于分析检测Hep2细胞，可以得到较为全面的质谱信号，主要原因可能是相比于其它两种基质，CHCA具有更好的激光能量转移及质子转移效率。 3.2 不同离子模式的影响 待测样品被离子化后，可能携带正电荷或负电荷，因此不同的离子模式对检测效果影响较大[12]。在正离子（LP）模式下，对于待测样品离子化后产生的阳离子有较高的灵敏度； 而在负离子（LN）模式下，主要是对阴离子有响应。为了实现待测样品的灵敏检测，对不同离子模式进行了考察。如图2所示，在负离子模式下，未检测到待测样品的任何信号，但是在正离子模式下，可以明显检测到Hep2细胞样品的信号。这是由于CHCA基质分子中羟基、 羧基具有可解离的氢质子，在激光的轰击作用下，解离出的质子在飞行过程中结合到待测样品上，使得待测样品分子结合质子带正电，从而在正离子模式下被检测到。所以本研究选用正离子检测模式进行后续实验。 3.3 不同激光能量的考察 对于MALDIMS分析，激光能量的高低直接影响信号强度的强弱。若激光能量较低，则不利于样品的离子化，从而检测不到样品信号； 若激光能量较高，一方面强的激光能量会破坏待测样品，使得质谱信号变得复杂，进而增加分析难度，另一方面强的激光能量会对激光器造成损伤，缩减其使用寿命。因此在保证不损伤激光器的前提下，选择适当的激光能量对样品解析电离至关重要。如图3所示，70%的激光能量时，得到的信号强度高，信噪比好，因此本研究选择70%的激光能量进行后续实验。 3.4 RSV病毒感染Hep2细胞的MALDIMS分析 Calderaro等[13]对Intestine 407细胞受RSV病毒感染前后的差异进行研究，发现有3个组分有明显差异表达。为了实现对RSV病毒的更全面分析，对RSV病毒感染Hep2细胞进行研究。为了获得较为准确的Hep2细胞受RSV病毒感染前后的质谱数据，且排除RSV病毒自身信号干扰，在上述优化的条件下，首先对单独RSV病毒的MALDIMS信号做了考察。如图4A所示，单独RSV病毒的质谱信号主要在m/z 4284.56、 4966.25、 8559.17和11607.49处出现质谱峰。继而通过MALDIMS质譜对病毒感染前后Hep2细胞进行考察。如图4B所示，通过对Hep2细胞感染RSV病毒前后的MALDIMS质谱图的比较，发现在m/z 6154.25、 7658.74及9259.82处质谱信号发生明显变化，其中m/z 6154.25的差异组分在RSV感染之后表达上调，m/z 7658.47和9259.82的差异组分在RSV感染后表达下调。有文献报道，RSV病毒感染Hep2细胞后白细胞介素6和白细胞介素8的表达存在显著差异[14]，此外RSV病毒感染所引起的炎性反应和免疫反应亦与肺泡表面活性物质的变化有关[15]，因此上述结果在筛选与RSV病毒诊断有关的生物标志物方面具有参考意义，同时也说明病毒感染和致病可能是由病毒因素和宿主细胞因素两方面相互作用的结果。上述实验结果还有待深入研究。 4 结 论 本研究利用MALDIMS高通量、 分析速度快及高灵敏等的优势，在不对细胞样品进行纯化处理的前提下，实现了对细胞的检测，初步建立了未感染细胞与RSV病毒感染细胞的鉴定方法。通过质谱分析技术，对正常Hep2细胞和RSV病毒感染的Hep2细胞进行比较，结果表明，被RSV病毒感染后某些组分的表达发生明显变化，其中组分m/z 6154.25发生上调，m/z 7658.74和9259.82发生下调。该差异表达可能来自两个方面，一方面是在病毒感染后，Hep2细胞自身代谢引起的组分变化，从而有助于Hep2细胞的进一步研究； 另一方面是RSV病毒自身作用引起的组分变化，有助于对RSV病毒的研究。本研究结果表明，MALDIMS技术在呼吸道合胞病毒疾病诊断与病理研究中有良好的应用潜能。 References 1 Zhan L， Wu W B， Yang L， Huang CZ. Anal. Chim. Acta， 2017， 962（15）： 73-79 2 Peters R M， Schnee S V， Tabatabai J， Schnitzler P， Pfeil J， McAdam A J. J. Clin. Microbiol.， 2017， 55（4）： 1032-1036 3 McGivney J B， Bishop E， Miller K， Jose C F， Yang H， Wei Z P， Strouse R， Schenermana M. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2011， 54（3）： 572-576 4 Rochelet M， Solanas S， Grossiord C， Maréchal P， Résa C， Vienney F， Barranger C， Joannes M. Talanta， 2012， 100： 139-144 5 Bawage S S， Tiwari P M， Pillai S， Dennis V， Singh S R. Adv. Virol.， 2013， 2013： ID595768 6 Zhong H Y， Marcus S L， Li L. J. Am. Soc. Mass Spectrom.， 2005， 16（4）： 471-481 7 CAO Dong， ZHANG YangJun， HAN ChunGuang， DENG YuLin， QIAN XiaoHong. Chinese J. Anal. Chem.， 2009， 37（1）： 1-7 曹 冬， 张养军， 韩春光， 邓玉林， 钱小红. 分析化学， 2009， 37（1）： 1-7 8 Gerl M J， Sachsenheimer T， Grzybek M， Coskun U， Wieland F T， Brugger B. Anal. Chem.， 2014， 86（8）： 3722-3726 9 Banoub J H， Newton R P， Esmans E， Ewing DF， Mackenzie G. Chem. Rev.， 2005， 105（5）： 1869-1916 10 PEI XingLi， HUANG YuYu， GONG Can， XU Xu. 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In order to research the pathogenesis of RSV， the matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry （MALDIMS）was used to explore the difference between uninfected cells and virusinfected cells. The result showed that， in the molecular weight range of 5000～10000 Da， there are three component peaks expressed with significant difference in both normal group and infection group. One of the three components was upregulated （m/z 6154.25） and the other two were downregulated （m/z 7658.47 and 9259.82） after RSV infection. This result proved the obvious differences between the infected cells and untreated cells.The differential expression may provide a feasible method for RSV disease diagnosis and pathology research， and also provide scientific evidences for research on development of RSV therapeutic drugs. Keywords Matrixassisted laser desorption/ionization mass spectrometry； Respiratory syncytial virus； Biomarker （Received 16 June 2017； accepted 12 December 2017） This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21535006）. |
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