| 标题 | 磁固相-内部萃取电喷雾电离质谱法快速测定人尿中的3-羟基苯并芘 |
| 范文 | 刘建川 张华 黄海春 沈友起 王亚男 张小平 摘 要 将磁固相萃取（MSPE）和内部萃取电喷雾电离质谱（iEESI-MS）技术相结合， 建立了直接快速检测人尿液中痕量PAHs代谢物3-羟基苯并芘（3-OHBaP）的方法， 并将此方法应用于吸烟人群与不吸烟人群尿样中3-OHBaP的检测。本研究以聚吡咯包覆的Fe3O4磁性纳米颗粒材料作为MSPE的介质， 通过优化各项实验参数（如固液比、毛细管电压、洗脱液组成、洗脱体积等）， 将吸附了尿液中3-OHBaP的纳米材料作为整体样品直接进行iEESI-MS分析， 以m/z 239的信号强度为定量指标， 获得最优实验条件。结果表明， 尿样基质中3-OHBaP在0.0005～2.500 μg/L浓度范围内与m/z 239的信号强度的线性关系良好， 检出限低至0.1 ng/L， 精密度（RSDs）小于8%， 整个样品分析过程不超过4 min， 且吸烟志愿者尿液中3-OHBaP浓度明显高于不吸烟志愿者。本方法操作简单、快速、环境友好， 可为人群健康风险评价提供参考依据。 关键词 磁固相萃取; 内部萃取电喷雾电离质谱; 多环芳烃; 3-羟基苯并芘; 健康风险评价 1 引 言 苯并芘即苯并[α]芘（BaP）， 由5个苯环组成， 其分布广泛， 且结构稳定难以降解， 是首个被发现的环境化学致癌物[1]， 其致癌性最强， 分布最广， 在食品、大气、水体、土壤等中广泛存在[2]。BaP可通过食物链的方式向人体转移， 最终在人体内蓄积。有研究表明， BaP在体内经功能氧化酶（如CYP1A1）代谢活化后， 形成二氢二醇环氧化物、反式二羟环氧苯并芘等， 这些代谢物很容易与DNA结合形成加合物， 导致基因的突变和非正常表达[3]。该DNA加合产物已在吸烟者的肺中被发现， 可直接导诱导肿瘤的形成， 在肺癌患者中表现尤为明显[4]。人通过空气、水、食物等不同程度的暴露接触BaP， 还容易诱发肺癌、皮肤癌、胃癌等多种疾病[5， 6]。此外， BaP的毒性具有长期和隐匿的特点， 在表现出症状前潜伏期可达25年左右[5]。因此， 建立快速、准确、高效地监测人体暴露BaP水平的检测方法， 对保障人类健康以及环境治理等具有重要意义。 3-羟基苯并[a]芘（3-OHBaP）是BaP的代谢标志物[7]。 因此，可通过检测人尿中BaP的代谢物（3-OHBaP）含量， 监测人体内BaP的暴露水平[7～10]。 目前， BaP代谢物检测方法主要包括高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FLD）[7]、气相色谱-质谱法（GC-MS）[11]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[9， 10]等。其中， HPLC-FLD方法操作繁琐， 耗时费力， 且灵敏度较低。GC-MS和HPLC-MS/MS方法具有灵敏度高和准确等特点， 然而， 这些方法通常需要复杂的样品预处理过程， 限制了对BaP的高通量分析， 不能满足对人体BaP暴露量快速评价的需要。因此， 开发简单、高选择性、高通量的方法分析人尿中痕量3-OHBaP显得尤为重要。人尿基质非常复杂， 且PAHs代谢物的含量极低。为进一步提高PAHs代谢物检测的灵敏度， 一些研究者利用磁性材料微孔共聚物与PAHs之间的疏水作用和π-π堆叠作用， 对复杂基体中的痕量PAHs代谢物进行富集， 从而实现PAHs的高通量定性和定量分析[12～14]。本课题组前期发展了一种磁固相萃取-内部萃取电喷雾电离质谱（MSPE-iEESI-MS）的检测方法， 首先是以聚吡咯包裹的Fe3O4作为磁固相萃取材料对尿液中的痕量1-羟基芘（1-OHP）进行选择特异性吸附， 再采用iEESI-MS技术进行分析， 方法的检出限低至0.1 ng/L[15]， 具有简单、省时、 灵敏度高等特点。芘是PAHs中含量最丰富的组分之一， 因此， 在评价PAHs暴露水平时， 1-OHP（芘的主要代谢产物）被广泛用作分析的目标物。但有研究者指出， 采用尿中1-OHP进行评价致癌PAHs的暴露程度不够准确。 首先， 芘本身是一种非致癌物; 其次， 不同地理环境中PAHs特性不同， 各成分的含量不同， 如排放源不同， 芘与BaP或其它致癌PAHs的含量比例差异很大[16， 17]。因此， 研究者们开始采用一些其它致癌物的代谢产物作为标志物或同时采用多种代谢标志物进行评估， 如3-OHBaP、羟基菲等[18， 19]。其中， 尿液中的3-OHBaP受到特别关注， 它是致癌性BaP的主要单羟基代谢产物， 与1-OHP相比， 尿液中3-OHBaP更适合作为致癌性PAHs暴露的生物标志物[18]。然而， 在体内， BaP可被代谢转化为酚类、二醇类、酮类或环氧类， 而这些代谢物主要随粪便排出， 尿液中3-OHBaP的含量极低（pg/mL级别）， 比尿液中1-OHP的含量要低几个数量级[16]。因此， 准确测定复杂尿液基质中低浓度的3-OHBaP难度较大。在前期研究基础上， 本研究采用MSPE-iEESI-MS技术对人尿液样品中的痕量3-OHBaP进行高效、高选择性、高通量定量分析， 并将此方法应用于吸烟人群和不吸烟人群志愿者尿样中3-OHBaP的快速检测。通过对比分析不同人群尿样中3-OHBaP的含量， 可监测人体内BaP暴露水平， 为人体健康风险评价提供参考依据。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 MSPE装置和iEESI离子源均由本实验室研制[15]; LTQ-XL线性离子阱质谱仪（美国Thermo公司）， 采用Xcalibur数据处理系统。3-OHBaP（GR级， 美国AuccStandard Inc公司）; 甲醇和乙酸（HLPC级， 美国ROE Scientfic公司）; 丙酮和苯（AR级， 国药集团化学试剂有限公司）。 2.2 磁固相萃取材料（[email protected]）的制备 聚吡咯涂覆的Fe3O4磁铁矿纳米复合材料合成方法参照文献[13， 20， 21]。首先采用溶剂热法制得磁性Fe3O4纳米球颗粒：称取5.0 g FeCl3·6H2O， 溶于100 mL乙二醇中， 加入15.0 g醋酸钠固体和50 mL乙二胺， 搅拌0.5 h， 将溶液转移到反应釜中， 于200℃条件反应8 h， 再用乙醇/水清洗數次， 得到磁性颗粒， 于60℃真空烘干， 备用。 称取磁性Fe3O4纳米球颗粒1.0 g、 FeCl3·6H2O 9.1 g， 加入100 mL去离子水， 室温下摇振3 h， 使Fe3+聚集在纳米球表面， 加入20 mL十二烷基磺酸钠和0.5 mL吡咯单体， 继续摇振反应12 h， 再用乙醇/水清洗数次， 至上清液澄清， 于60℃真空烘干， 即得到聚吡咯包裹磁性Fe3O4复合材料。 2.3 尿液样本的采集 尿液样本由12名健康志愿者（7名不吸烟者和5名吸烟者）提供。收集每位志愿者晨尿于100 mL棕色玻璃瓶中， 在80℃保存， 实验前将尿液室温解冻。利用[email protected]材料对3-OHBaP的特异性吸附作用， 在尿液样品中加入过量的[email protected]材料， 吸附去除可能存在的3-OHBaP， 再采用磁铁将[email protected]材料吸附分离， 剩余的尿液样本作为空白。取适量3-OHBaP标准品， 用甲醇配制成100 μg/mL的储备液， 于4℃保存， 实验时配制一系列浓度（0.0005～2.500 μg/L）的加标尿液样本， 用于MSPE-iEESI-MS分析。 2.4 MSPE-iEESI-MS方法的建立 MSPE-iEESI-MS的工作流程参见本课题组前期工作[15]。原理为：依据[email protected]对3-OHBaP的特异性吸附作用， 将磁固相萃取介质[email protected]与iEESI-MS技术结合， 对人尿中痕量3-OHBaP进行吸附， 再将吸附了3-OHBaP的[email protected]作为整体样品， 选取合适的萃取剂进行洗脱， 最后进入质谱分析。具体步骤如下：称取0.1 mg [email protected]于15 mL玻璃瓶中， 依次分别加入2 mL甲醇和2 mL去离子水进行超声活化30 s， 磁分离; 移取10 mL尿液样品于上述玻璃瓶中， 涡旋1 min， 使[email protected]充分吸附尿样中的痕量3-OHBaP， 再将混合物装入2.5 mL进样针中， 用磁铁将材料吸附在注射器的内壁上， 将尿液排出。为了避免尿基质对3-OHBaP电喷雾溶液造成干擾， 用1 mL去离子水洗涤进样针中的[email protected]两次， 再加入萃取剂将[email protected]上的3-OHBaP进行洗脱， 轻轻摇晃使萃取剂与[email protected]充分混合， 使洗脱效果达到最佳。 3 结果与讨论 3.1 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定性分析 3.2 人尿中3-OHBaP的MSPE-iEESI-MS快速定量分析 向10 mL空白尿样中加入一系列（0.0005～2.500 μg/L）的3-OHBaP标准溶液， 在最优的实验条件下， 采用MSPE-iEESI-MS进行快速检测分析， 每个浓度样品重复测定6次， 绘制特征离子m/z 239信号强度的平均值与3-OHBaP对应浓度的关系曲线。 结果表明， 采用MSPE-iEESI-MS方法可以快速定量检测人尿中痕量3-OHBaP， 在0.0005～2.50 μg/L浓度范围内， 3-OHBaP的二级离子信号强度与其浓度具有良好的线性关系， 线性回归方程为y = 5.063x + 1.555（R2 = 0.9989）（图3）， 对3-OHBaP的检出限为0.1 ng/L[23]， 相对标准偏差（RSD）低于8%。单个样品分析时间小于4 min。上述结果表明， 对于含有ng/L级的3-OHBaP未稀释的尿样本， 可不经过复杂预处理， 直接采用MSPE-iEESI-MS进行检测。这是因为磁性材料[email protected]对尿液中3-OHBaP的高效选择性与特异性吸附， 以及MSPE-iEESI-MS特有的样品加载过程， 有效避免了目标物的损失。采用MSPE技术可对大批量的尿液样本进行快速处理， 进一步提高分析通量。 3.3 尿样中3-OHBaP的快速测定 采用本方法对12名健康志愿者（其中5名吸烟者和7名不吸烟者）实际尿液样本中的痕量3-OHBaP进行定量分析。实验结果见表1， 在非吸烟者尿液中检测到的3-OHBaP浓度为0.23～0.76 μg/L， 而经常吸烟者尿液中的3-OHBaP含量均大于1.48 μg/L。 4 结 论 采用MSPE-iEESI-MS技术， 对人尿样中3-OHBaP进行了定性和定量分析。此方法操作简单、省时、环境友好， 能够区分吸烟者与不吸烟者人体内痕量3-OHBaP内部剂量的差异性， 可为人体内PAHs暴露的健康风险评估提供参考依据。本研究结果表明， 将常压质谱技术与MSPE结合， 可为复杂基体生物和环境样品中痕量待测物的高通量分析提供有效的策略。 References 1 Juhasz A L， Naidu R. 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