| 标题 | 基于固相萃取膜盘技术分离富集海水中软骨藻酸 |
| 范文 | 王九明 陈军辉 何秀平 李晓彤 吴丹妮 郑晓玲 王小如 摘?要?软骨藻酸（Domoic acid， DA）是由海洋硅藻产生的一种可致人记忆缺失的亲水性毒素，对海产养殖业以及人类健康造成严重威胁。本研究建立了一种高效富集海水中微量DA的新方法，结合高效液相色谱-紫外检测/质谱分析实现了养殖海水中DA的检测。利用磺化苯乙烯-乙烯基苯共聚物材质的固相萃取膜盘，对经甲酸酸化处理的海水样品中的DA进行富集、净化;采用反相C18色谱柱分离DA，以含2.0 mmol/L乙酸铵和0.1%（V/V）甲酸的90.0%（V/V）乙腈为流动相，紫外检测波长为242 nm。在最佳实验条件下，对海水中DA的富集倍数可达2000倍，平均回收率89.3%，具有良好的精密度（相对标准偏差（RSD）≤4.0%）;海水中DA的检出限（S/N=3）为2.5 ng/L， 使高效液相色谱-紫外检测能满足实际海水中DA测定的灵敏度要求。采用本方法对中国东海部分海域海水中的DA进行了检测，在两个站位海水样品中检出DA，含量最高可达2.7 μg/L。本方法操作简单、灵敏度高，是近海养殖海水环境中DA测定的有效方法。 关键词?软骨藻酸; 盘式固相萃取; 海水; 高效液相色谱 1?引 言 当前，海洋环境污染日趋严重，赤潮现象频频发生。由赤潮生物暴发所产生的大量生物毒素通过食物链进入人体，进而威胁人类健康[1]。软骨藻酸（Domoic acid， DA）是一种具有神经毒性的氨基酸类化合物，是记忆丧失性贝毒的主要成分，主要由海洋硅藻-拟菱形藻（Pseudo-nitzschia）产生[2]。DA能够引起海洋哺乳动物及人类中毒， 甚至死亡[3～8]。鉴于其对人类健康存在的潜在威胁，国际食品法典委员会（CAC）规定贝类中DA的安全限量为20.0 μg/g[9]，美国、加拿大、欧盟、日本和中国等国家相继执行此国际标准。 近年来，有害拟菱形藻及其产生的DA在全球海域的分布范围逐渐扩大[10，11]。本格拉上升流海域检测到DA的最高浓度达180 ng/L[12]; 在法国北海海域近岸海水中DA浓度在102～263 ng/L之间[13]。2015年5～8月在美国北部西海岸暴发的一次大规模产毒拟菱形藻藻华事件， 造成大量海豚、海狮及海鸟死亡，在该海域螃蟹等海产品中检出高浓度DA，已超出其安全限量范围[14]; 2017年中国近海发现能够产生DA的拟菱形藻[15]，南海海域多个批次海产品中也检出DA，在扇贝中的累积量高达10.1 μg/g[16]。DA对海产养殖业带来了严重威胁，因此需对DA进行有效检测与监测。目前，DA的检测方法主要有生物分析法[17]、高效液相色谱法[18]、荧光检测法[19]、质谱法[20]、酶联免疫分析法[21]和毛细管电泳法[22]等。其中，高效液相色谱法及高效液相色谱-质谱联用技术具有准确性高、稳定性好的特点，是目前测定DA的最佳方法。海水是海洋养殖生物的栖息地，海水中毒素的浓度水平直接影响海产品的食用安全，而对海洋养殖环境水体中毒素的有效检测是海产养殖安全管理的前提。由于海水中DA含量较低，且DA是一种极性较大的亲水性物质，对高盐海水基质中的DA直接进行仪器检测和快速富集比较困难。无定型TiO2[23]、分子印迹聚合物[2，5]、磁性材料[24]等常被用作吸附剂，对海水中的DA进行分离富集，然而这些吸附材料还未实现产业化生产，无法进行广泛推广应用。采用商品化C18固相萃取柱可实现海水中DA的富集，但富集倍数仅20倍[25]; 利用商品化的反相C18固相萃取膜盤对海水中的DA进行富集时，富集倍数为20倍，回收率达90.0%以上，然而通过增加海水上样量提高富集倍数时，方法的回收率明显下降[26]，说明该方法富集倍数和效率低，不适于海水中痕量DA的高效富集。因此，急需开发对海水中痕量DA分离效果好、富集倍数高，并且能够推广应用的新富集方法。 固相萃取膜盘技术由于具有盘片上吸附剂分布均匀、超低溶出及动力学高效率（高流速不会影响回收率）的特点，在大体积水样处理中具有传统SPE小柱无法比拟的优势，已成为环境水体微量污染物快速富集、净化的高效方法[26，27]。本研究采用磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）共聚物材质且对极性化合物有高效吸附性的固相萃取膜盘，结合高效液相色谱-紫外检测/质谱分析法，建立了一种针对海水中痕量DA进行高效富集测定的新方法，并将其应用于东海海域海水样品中DA的测定。 2?实验部分 2.1?仪器、试剂与药品 1220型高效液相色谱仪、6320型电喷雾离子阱质谱仪（美国Agilent公司）; FA1104 型电子天平（上海精天电子仪器厂）; Milli-Q超纯水处理系统（美国Millipore公司）; KQ-400KDE 型高功率数控超声波仪（昆山市超声仪器有限公司）; RE100-pro旋转蒸发仪（北京大龙公司）; 磺化苯乙烯-乙烯基苯（SDB-RPS）固相萃取膜盘、C18固相萃取膜盘（47 mm，美国3M公司）; 5 TC-C18 （2） 色谱柱（150 mm×4.6 mm）、 Poroshell 120 色谱柱（100 mm× 3.0 mm）、ZORBAX 300 SB-C18色谱柱（150 mm×3.0 mm， 3.5 μm）均购于美国Agilent公司; 0.22 μm 混合纤维膜（上海市新亚净化器件厂）。 甲酸（色谱纯）、乙酸铵（优级纯）（瑞士Fluka公司）; 甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）; 丙酮、异丙醇（色谱纯，德国Merck公司）; DA 标准品（美国Sigma公司）; 实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 ?MΩ cm）。 2.2?高效液相色谱-质谱条件 色谱条件： Agilent 5 TC-C18 （2） （150 mm×4.6 mm， 5.0 μm）色谱柱，90.0%（V/V）乙腈（含2.0 mmol/L 乙酸铵+0.1%甲酸）为流动相，等度洗脱，柱温35℃，流速1.2 mL/min，二极管阵列检测器（DAD）检测波长242 nm，进样量20.0 μL。与质谱联用分析时，由HPLC流出进行分流，使得进入质谱的流动相流速为0.3 mL/min。 质谱条件： 电喷雾正离子模式检测，全扫描范围为m/z 100～500，干燥气温度350℃，干燥气流速10.0 L/min，喷雾气压力206.8 kPa。二级质谱分析选择DA的母离子为[M+H]+ （m/z 312.2），生成特征碎片离子m/z 266.2、294.2、248.2。 2.3?样品前处理方法 取2.0 L海水样品，经孔径为0.22 μm的滤膜过滤去除悬浮颗粒物，加入8.0 mL甲酸进行酸化处理，然后进行固相萃取膜盘富集。首先对SDB-RPS固相萃取膜盘进行活化处理： 加入10.0 mL丙酮，使丙酮溶液通过膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL异丙醇，使异丙醇溶液通过膜片浸泡30 s，抽干; 加入10.0 mL甲醇，待甲醇溶液只剩约1.0 mL时，加入10.0 mL水，待膜片上保留约1.0 mL水时，固相萃取膜盘完成活化。取酸化后的海水样品，以6.0 mL/min的流速过固相萃取膜盘，加入20.0 mL水对膜盘进行淋洗，抽干; 使用20.0 mL 80.0%（V/V）甲醇分2次对DA进行洗脱，合并洗脱液，采用旋转蒸发仪在50℃下将洗脱液进浓缩至干，用1.0 mL 乙腈-水（1∶19， V/V）复溶，转移到进样小瓶中，待测。 3?结果与讨论 3.1?色谱条件的优化 由文献[28，29]可知，DA有较强的紫外吸收，为了能获得较高的灵敏度，在210～400 nm范围内进行扫描。由DA的紫外吸收光谱图（图1A）可见， DA的最大吸收峰在242 nm处，因此选择242 nm作为DA的最佳检测波长，这与文献[21]结果一致。反相C18色谱柱常用于DA的HPLC分离分析[5，30]; 考虑到DA是一种极性较大的弱酸性化合物，在反相C18色谱柱上保留较弱，本研究以水-乙腈混合液为流动相，对3根同一厂家不同碳载量的C18色谱柱（5TC-C18（2）、Poroshell 120、ZORBAX 300 SB-C18色谱柱）进行了比较，结果表明，Agilent 5 TC-C18（2） 色谱柱的分离效果最理想，分离度高， 并且峰形尖锐对称，说明不同的色谱柱对海水中的DA分离结果差异较大，选择碳载量相对较低的C18柱尤为关键。在最佳色谱分离检测条件下，对添加DA标准品的海水樣品进行了分析，色谱图如图1B所示，DA色谱峰尖锐对称，与海水中的干扰组分达到了良好分离，可以准确积分其峰面积， 进而对海水中DA进行定量测定。 3.2?前处理条件的优化 3.2.1?固相萃取膜盘的比较优化?C18固相萃取小柱和膜盘已成功用于水体中DA的有效富集[27，28]。鉴于DA是一种亲水性较强的极性化合物，而SDB-RPS固相萃取膜盘对环境水体中强极性化合物有良好的富集效果，所以本研究采用空白海水添加DA标准品为阳性样品，对C18固相萃取膜盘和SDB-RPS固相萃取膜盘富集海水中DA的效率进行了比较。结果表明， SDB-RPS固相萃取膜盘对海水中DA的富集效率是C18固相萃取膜盘的1.3倍。本研究选取SDB-RPS固相萃取膜盘用于海水中DA的富集。 3.2.2?海水酸化条件的优化?DA是一种弱酸性物质，在水溶液中易发生电离，不利于DA在固相萃取膜盘上富集。为提高固相萃取膜盘对海水中DA的富集效率，在海水样品中加入适量酸，通过抑制其电离，可提高方法的富集效率。以不添加甲酸的加标海水样品为对照，对海水样品添加甲酸的量进行了优化。如图2所示，在对照海水样品中未检测到DA，说明在海水样品未经酸化处理的条件下，固相萃取膜盘对海水中DA没有明显的吸附作用。在加入0.2%～0.5%甲酸酸化的加标海水样品中，均检测到了DA，说明固相萃取膜盘对酸化后的海水中DA有明显的富集作用; 而加入0.4%甲酸酸化的海水样品，固相萃取膜盘对其DA吸附效率最高。最终选择加入0.4%甲酸对海水样品进行酸化处理。Wang等[31]也采用添加0.4%甲酸对海水样品进行酸化处理，以提高C18固相萃取小柱对海水中DA的富集效果。 3.2.3?洗脱剂优化?在固相萃取前处理过程中，选择合适的洗脱剂对于提高方法的回收率和重复性至关重要。考察了20.0 mL 20.0%、50.0%、80.0%、90.0%、100.0%甲醇作为洗脱剂时，对SDB-RPS固相萃取膜盘上吸附的DA的洗脱效果。如图3所示，采用80.0%甲醇作为洗脱剂时，洗脱效果最好。 3.2.4?海水去除悬浮颗粒物滤膜的优化?海水在进行固相萃取膜盘处理之前先经过微孔滤膜进行过滤，以除去海水中悬浮固体颗粒物，减小基质对固相萃取膜盘的阻塞和对目标化合物吸附效率的影响。孔径为0.45和0.22 μm的滤膜常用于去除海水中的悬浮固体颗粒物，本实验对这两种孔径的滤膜进行了比较，结果表明，选用孔径为0.22 μm的滤膜比孔径为0.45 μm的滤膜具有更好的效果（1.2倍）。 3.3?方法学考察 本研究采用高效液相色谱-紫外检测、外标法对海水样品中的DA进行定量分析，以峰面积对目标化合物的浓度做标准曲线。DA浓度在0.01～4.0 mg/L范围内线性关系良好，相关系数R2=0.9998。在空白海水中加入DA标准溶液，按照2.3节方法进行处理，以逐渐降低空白加标海水中DA浓度的方法确定方法的检出限。将信噪比（S/N）为3时所对应DA在海水中的质量浓度为检出限（LOD），方法的LOD为2.5 ng/L。在文献[18]中采用C18固相萃取膜盘结合高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定海水中DA的方法， 检出限为20.0 ng/L，而本方法采用高效液相色谱紫外检测具有更好的灵敏度，主要得益于SDB-RPS固相萃取膜盘能对大体积海水样品中的DA进行高效富集。 取同一浓度加标海水样品5份，采用本方法测定DA峰面积的RSD为5.4%，保留时间的RSD为0.02%，表明本方法重复性良好。采用2.0 L空白海水进行DA标准添加实验，海水中分别添加20.0、80.0和160.0 ng/L的DA，采用本方法进行测定，回收率分别为90.1%、86.3%和91.6%，RSD（n=3）分别为1.7%、4.0%和0.2%，说明本方法可用于实际海水样品中DA含量的测定。C18固相萃取膜盘法对海水中DA的富集倍数≈20时，回收率达到85.0%; 但是，通过进一步增加海水上样量而提高富集倍数时，回收率明显下降。本研究发展的SDB-RPS固相萃取膜盘富集法，对海水中DA的富集倍数高达2000，较文献[23]方法的富集倍数提升了100倍，回收率为86.3%～91.6%，表明本方法可用于海水中DA的高效富集。 3.4?实际海水样品分析 海水中DA的定性鉴别过程如下： 首先对DA标准溶液和经固相萃取膜盘处理的海水样品进行HPLC-DAD-MS检测，通过比较DA标准溶液和海水样品中目标化合物的紫外检测色谱图（图 4）可见，海水样品检出化合物保留时间与DA标准品保留时间一致，并且DAD全波段扫描获得的紫外吸收光谱图也一致，即初步说明此化合物是DA。应用本方法对从东海4个站位采集到的海水样品进行了检测，其中的两个站位的海水样品中检出DA。 DA的相对分子质量为311.2，电喷雾一级质谱分析可以产生特征离子为m/z 312.2，根据质量数确定此离子为[M+H]+。以 m/z 312.2 [M+H]+为母离子，对DA标准品溶液和海水样品进行二级质谱分析，可见海水中目标化合物（图5B）与DA标准对照品的二级质谱特征离子（图5A）一致，3个丰度较高的碎片离子均为m/z 266.2 [M+H-HCOOH]+，m/z 248.2 [M+H-HCOOH-H2O]+ 和m/z 294.2 [M+H-H2O]+，进一步确定海水中检测到的化合物为DA。 HPLC-DAD对海水中DA测定结果表明，两个站位海水样品中DA的浓度分别为0.1和2.7 μg/L， 说明我国东海部分海域的海洋生物面临一定程度的DA污染威胁。这是首次从我国东海海水中检测到溶解态DA。与威尼斯Lagoon湖及周边海域环境水体中的DA含量（1.5～16.2 ng/L）[32]?對比可知，本方法测得的东海部分海域海水中DA浓度明显偏高。海水中高浓度DA的发现进一步证明该海域存在大量产DA毒素的浮游植物，这也增加了该海域海洋生物DA的污染风险。因此，加强对该海域DA含量的监测，避免有毒有害藻华的爆发以及藻毒素中毒事件的发生，对于保护近海环境、海洋渔业和养殖业健康发展、海产品安全具有重要意义。 4?结 论 建立了一种基于固相萃取膜盘富集的高效液相色谱-紫外检测/质谱测定海水中溶解态DA的新方法。与传统的固相萃取小柱法相比，固相萃取膜盘法的海水样品上样速度快、富集倍数高、不易堵塞，适于在调查船对海水中微量DA的现场快速富集。利用SDB-RPS固相萃取膜盘对2.0 L海水中微量DA进行快速富集，富集倍数高达2000倍，方法回收率和重复性良好，使常规高效液相色谱-紫外检测法达到了测定实际海洋环境水体中DA的灵敏度要求。本研究也为大体积远洋环境水体或极地海水中痕量有机物现场快速富集方法的建立提供了新思路，为解决海水样品体积大、不易在调查船上长期冷冻保存和运输的难题提供了新方法。 References 1?SHEN Hui-Hui， CHEN Jun-Hui， XU Xiu-Li， PAN Lei， HE Xiu-Ping， WANG Xiao-Ru. 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