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苦瓜下胚轴的离体再生体系

范文

潘琼玉田丽波商桑邹凯茜周萌萌朱国鹏曾丽萍

摘要：为了建立高频的苦瓜离体再生体系，为苦瓜遗传转化提供技术基础，筛选了最适消毒方法和外植体类型。以MS培养基为基础培养基，添加不同浓度激素组合，筛选最适于苦瓜不定芽诱导、伸长和生根的培养基。最佳的消毒方法为：用水浸泡去壳的种子15 min，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s后再用4% NaClO浸泡6 min，用无菌水冲洗4～5遍，污染率为0，发芽率为98%;最佳的愈伤组织诱导培养基为MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA，愈伤组织密度为0.79 g·cm-3，不定芽的分化率为39%，最佳外植体为下胚轴（12 d），诱导率为41%;最佳的增殖培养基为MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA;最佳的生根培养基为MS+0.1 mg·L-1 IBA，移栽存活率为74%。初步建立了苦瓜离体再生体系。

关键词：苦瓜;再生体系;离体培养;愈伤组织

In vitro regeneration system of bitter melon

PAN Qiongyu， TIAN Libo， SHANG Sang， ZOU Kaixi， ZHOU Mengmeng， ZHU Guopeng， ZENG Liping

（College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou 570228， Hainan， China，）

Abstract： In order to establish the high-frequency in vitro regeneration system of bitter melon， and provide technical basis for the genetic transformation of bitter melon， the optimal disinfection method and explant type were screened. MS medium was used as the basic medium， and added different concentrations of hormones. The most suitable medium for adventitious bud induction， elongation and rooting of bitter melon were selected. The best disinfection method was： soaking the shelled seeds in water for 15 min， 75% alcohol for 30 s in the ultra-clean workbench， 4% NaClO for 6 min， and rinse with sterile water for 4-5 times. The germination rate reached 98% without any pollution. The best callus induction medium is MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA. The callus density was 0.79 g·cm-3， and the adventitious bud differentiation rate was 39%. The optimal explant was hypocotyl （12 d）with duction rate 41%. The best proliferation medium is MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA. The best rooting medium is MS+0.1 mg·L-1 IBA. The transplanting survival rate was 74%. An in vitro regeneration system of bitter melon was established.

Key words： Bitter melon; Regeneration system; In vitro culture; Callus

苦瓜（Momordica charantia L.）為葫芦科苦瓜属一年生攀援状柔弱草本植物，苦瓜性味甘苦寒凉、无毒，具有清热解毒、补肾阳、祛寒湿、降血糖[1]、抗菌、抗肿瘤、抗病毒[2]等药用功效，是一种食药兼用的植物，在全世界广泛种植，也已成为海南省的支柱蔬菜种类之一。但苦瓜常规育种的难度大、周期长、遗传性状不稳定，而苦瓜基因组测序已经完成[3]，利用分子标记辅助育种、转基因育种、基因编辑育种或设计育种已经成为可能，遗传转化体系的建立对种质资源的创新和新品种培育非常重要，而再生体系的建立是这些工作的基础，也是目前研究的热点，且离体再生能缩短植物的生长周期，固定杂种优势，其再生无菌苗不带任何病菌。

目前，国内外做过许多针对苦瓜的研究，主要集中在杂种优势利用、栽培技术以及近年来对其药用性的研究。而苦瓜的再生体系这方面开始研究的时间比较晚，且效果不显著，苦瓜外植体易于诱导出愈伤组织而难以分化出再生芽。而且，不同研究人员的试验结论差异较大，高浓度的6-BA不利于丛生芽的伸长，但一定浓度的IAA和6-BA的组合配比对丛生芽的诱导有促进作用[4]。冯锐等[5]单独用3.0 mg·L-1的KT时，丛生芽增殖效果为其他的4.9倍，且苗健壮，长势好。还有用噻苯隆（TDZ）对苦瓜丛生芽进行诱导的[6-9]。Tang[10]发现单独用BAP能诱导芽分化。有用CSH和TDZ搭配加在MS中诱导苦瓜外植体为子叶的愈伤组织发芽[11]。还有用2，4-D对外植体进行愈伤诱导的试验[12-13]。在用外植体直接诱导出丛生芽的阶段，植物苗龄也是影响不定芽诱导能否成功的重要因素之一[14]。王国莉等[15]用3个不同生长阶段的苦瓜无菌苗进行试验，结果证明，10 d前后苗龄是诱导子叶节丛生芽的最适时期。

当前已有的离体培养再生体系并不适于所有的苦瓜遗传转化，建立适宜的苦瓜离体再生体系十分必要，这不仅具有一定难度，还具有一定的创新性。笔者对苦瓜的离体培养和植株再生条件进行研究，以期为建立苦瓜遗传转化体系提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

‘海研二号苦瓜，由海南大学热带农林学院苦瓜课题组提供;MS培养基配方：蔗糖30 g·L-1，琼脂7.5 g·L-1，pH 5.8～6.0。试验于2017年11月至2018年6月在海南大学热带农林学院品种改良试验室进行。

1.2 方法

1.2.1 培养条件培养温度为27～29 ℃，光照强度为2 000 Lx，每日光照16 h，黑暗8 h。

1.2.2 种子无菌萌发用以下3种消毒方式：（1）将种子去壳，用水浸泡15 min，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡4 min，用无菌水冲洗4～5遍;（2）将种子去壳，用水浸泡15 min，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡6 min，用无菌水冲洗4～5遍;（3）将种子去壳，用水浸泡15 min，在超净工作台中用75%酒精浸泡30 s，再用4% NaClO浸泡8 min，用无菌水冲洗4～5遍。每个方法3次重复。将消毒好的种子接种到MS培养基中，每瓶1粒，各接20瓶（待确定最佳的消毒方式后，接种时每瓶接种3～5粒），放入培养箱中暗培养，种子露白后移到光下。7 d后统计发芽率和污染率，比较各种消毒方法的效果和无菌苗的生长情况，得出最佳的消毒方式。

1.2.3 外植体的取材待接种6～7 d后（苦瓜苗长势如图1-a），将无菌苗子叶（外植体1）和下胚轴（外植体2）切下，下胚轴取4～5 mm，子叶取5 mm×5 mm作为外植体;待接种12 d后（苦瓜苗长势如图1-b），将无菌苗下胚轴（外植体3）和顶芽（外植体4）切取4～5 mm，用手术刀切取新叶和真叶，轻轻刮去生长点作为外植体。

1.2.4 愈伤组织及不定芽的分化每种外植体取20个，将外植体顶端朝上，插在诱导培养基中。MS+（1、1.5、2、2.5、3） mg·L-1 6-BA+（0.01、0.02） mg·L-1 IBA配比的愈伤组织诱导培养基中（表1），14 d内统计各愈伤组织的启动时间，28 d后记录愈伤组织的形成率和愈伤组织质地。选出最佳诱导培养基。将培养了30 d后的愈伤组织接种到最佳诱导培养基中进行继代培养。继代培养14 d后记录芽原基分化情况。30 d后，统计不定芽分化率和不定芽数量。

愈伤组织形成率/%=形成愈伤组织的叶柄数/接种的叶柄外植体总数×100;

愈伤组织密度= 20 块愈伤组织的鲜质量（g）/20 块愈伤组织的体积（cm3）。

愈伤组织体积的测量方法为：每一批取20块愈伤组织浸入到200 mL 的無菌水中，溢出水的体积即为20 块愈伤组织的体积。

不定芽的分化率/%=分化出不定芽的愈伤组织数/接种愈伤组织总数×100。

1.2.5 增殖培养将已长出大量不定芽的愈伤组织切成约4 mm×4 mm大小，转接到MS+（1、1.5） mg·L-1 6-BA+（0.005、0.01） mg·L-1 IBA和不加激素的MS增殖培养基中，比较不同浓度激素对不定芽的影响，2周后记录不定芽伸长率和伸长量。

1.2.6 生根培养以MS和1/2MS为基本培养基，分别添加0.01、0.02 mg·L-1 IBA，探索无机盐和不同浓度IBA对不定根诱导的影响，15 d后分别统计不定根的发生率和数目，选出最佳生根培养基。

1.2.7 炼苗试验将根长2.5～3.0 cm的再生苗除去瓶盖，加入刚好能没过培养基的水，放在室温下培养2～3 d，将再生苗取出，洗净根部培养基，移栽到装有无菌土（V营养土∶V基质 = 3∶1）的定植盆中，浇透定根水，再在室温中暗培养3 d。3 d后移至正常光下，每天浇1次水，15 d后统计成活率。

2 结果与分析

2.1 种子的无菌萌发

由表2可知，方法2的发芽率和污染率都显著好于其他2种方法。3种消毒方法的发芽率都较高，第2种方式发芽率发到98%，污染率为0，是本次试验中最佳的消毒方式。第1种方法虽然发芽率也高达93%，但是消毒不彻底;第3种方法虽然消毒较彻底，但消毒过度，伤害到种子的胚，造成发芽率降低。

2.2 不同外植体类型对不定芽诱导的影响

由表3可以看出，外植体1和外植体2较难诱导出不定芽。外植体3和外植体4都能诱导出不定芽，而外植体3（图1-c）诱导率最高，如图1-d，为41%，且显著高于其他外植体。因为前期处理外植体时，已经把芽点都处理干净，诱导得到的芽14 d左右才能形成，长得慢;普通的芽5 d左右便形成了，长得快，可以区别开来。所以，外植体3为本次试验的最佳外植体。

2.3 不同激素类型、浓度配比对不定芽的诱导试验

将本次试验中选出的最佳外植体下胚轴（12 d）接种到由不同浓度激素配比的诱导培养基中，一定时间记录愈伤组织的分化情况。从表4中可以看出，随着6-BA浓度的提高，愈伤组织启动时间越快，愈伤组织的形成率也随着提高。当6-BA质量浓度为2.5 mg·L-1、IBA为0.01 mg·L-1时，愈伤组织密度达到最高，为0.79 g·cm-3，愈伤组织比较致密。

后续培养可看到愈伤组织分化出密密麻麻的芽原基，继代培养14 d左右可形成小苗，再过14 d转接到不定芽伸长培养基中。由表2得出，当6-BA为2.5 mg·L-1、IBA为0.01 mg·L-1时，不定芽的分化率为39%，不定芽数目较高，为7.1个。7号培养基的愈伤组织密度、不定芽分化率、不定芽数都显著高于5号培养基。因此，7号诱导愈伤培养基MS+2.5 mg·L-1 6-BA+0.01 mg·L-1 IBA是最适合苦瓜外植体3愈伤组织及不定芽诱导的培养基。

2.4 不定芽的伸长

从表5可知，提高6-BA浓度不利于不定芽的伸长，而适当地提高IBA浓度，有利于不定芽的伸长。当6-BA质量浓度为1.0 mg·L-1、IBA为0.005 mg·L-1时，不定芽伸长率为90%，芽平均长度为0.87 mm。较低的激素有利于不定芽的生长，但配比不合适的培养基会让愈伤组织出现玻璃化和褐化，造成不定芽的死亡。且3号的不定芽伸长率和芽均长都显著高于其他培养基。因此，最适合苦瓜不定芽伸长的培养基是3号MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.005 mg·L-1 IBA。

2.5 生根培养

从表6中可以看出，随着无机盐浓度的降低，无菌苗的生根率和平均根数升高，但是存活率降低。所以，MS培养基比较有利于无菌苗的存活。随着IBA浓度提高，无菌苗的生根率和平均根数、移栽成活率降低，配合MS的使用，当IBA质量浓度为0.1 mg·L-1时，无菌苗的生根率、平均根数和移栽成活率达到最高，分别为42%、5.67条、74%。1号生根培养基的平均根数显著高于2号、4号，移栽成活率显著高于2号、3号。所以，1号生根培养基MS+0.1 mg·L-1 IBA是本次研究中最适合苦瓜无菌苗生根和移栽的培养基。

2.6 试管苗移栽

当试管苗的根长达到2.5～3.0 cm，如图1-e，进行炼苗移栽。每天浇1次水，2周后统计成活率，为74%，图1-f即为成活。

3 讨论与结论

起始外植体材料是影响植物离体再生的重要因素。外植体再生能力与外植体取材部位、切割方法、外植体的年龄以及材料的极性等因素相关[16]。外植体材料需具有大量再生能力强的细胞群存在，才能在生长调节剂的诱导下脱分化。罗燕华的试验表明苦瓜的幼叶、下胚轴和愈伤组织诱导分化很难，而子叶节却可以直接诱导出丛生芽[4]。真叶、上下胚轴等外植体愈伤组织生长速度比较缓慢[4]，而子叶、下胚轴和幼根的愈伤组织的生长速度快[17]。在西瓜中，很多组织和器官都能作为西瓜的外植体，比如子叶、茎尖、幼叶、顶芽等，但即使是在同一植株上，其诱导率也存在差异[18]。本研究的最佳外植体为外植体3，即苗龄为12～14 d的下胚轴，和罗燕华[4]的结果不同，可能与采用的下胚轴的生长状态不同有关;用子叶、顶芽和下胚轴（苗龄为6～8 d）没有诱导出不定芽，原因可能是外植体内源激素与培养基的激素配比不合适，而且不同外植体在诱导不定芽的能力上也是有区别的。

植物组培中的一个很重要的条件是植物培养基种类和成分。培养基的成分与植物是否能成功生长有直接关系。生长素和细胞分裂素能很好地促进丛生芽的发生[5]。影响植物愈伤组织的形成的一个重要因素是不同的激素组合配比。王国莉等[15]在2组激素组合MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 NAA和MS+2.0 mg·L-1 玉米素（ZT）+0.1 mg·L-1 萘乙酸（NAA）中，3种基因型苦瓜的诱导率都是最高的，每10个外植体得到30个左右的丛生芽。潘绍坤等[19]研究苦瓜再生植株时发现，加入IAA和吲哚丁酸（IBA）的每个处理的不定芽再生率都很高。笔者发现，2.5 mg·L-1 6-BA配合0.01 mg·L-1 IBA可以使‘海研二号苦瓜的下胚轴（12 d）愈伤组织不定芽分化率达到最高。高浓度的6-BA虽然对愈伤组织的诱导效果很好，对不定芽的分化起关键性作用，但也造成丛生芽不易伸长、畸形和玻璃化的现象。而且转接次数越多，培养时间越长，苦瓜也可能出现基因变异，会影响后续的再生能力。以上结果表明了作物的种类和基因型、植物生长调节剂的种类、浓度都是影响外植体再生的重要因素。

苦瓜具有很高的食用和药用价值，不论是在品质改良，或是提高抗性等方面，苦瓜都有着很大的潜力。而常规育种技术难以获得的新種质，可以利用分子育种改良品质、提高抗病、抗逆或抗虫性，获得新的优良品种，这将会为苦瓜的遗传育种开辟新的道路。所以，苦瓜的离体再生体系的研究将会加速育种进程。而与其他葫芦科的植物相比，由苦瓜外植体诱导不定芽的过程还是十分困难，不定芽的诱导率为39%，甜瓜再生率在45%[20]、67%[21]、88.67%[22]，西瓜为83.32%[23]、87.78%、82.78%和 86.11%[24]，黄瓜为50.0%、56.3%[25]、96.2%[26]，南瓜为19.8%和20.1%[27]、64.5%[28]，且不定芽畸形和玻璃化等不正常现象出现频繁。如何进一步提高苦瓜不定芽的诱导率，解决不定芽的不正常现象，建立一个稳定高效的再生体系，是值得研究的问题。

通过严格的无菌操作、对苦瓜外植体培养条件的筛选和改善、观察和统计愈伤组织和不定芽伸长情况及不定芽数量，初步建立了苦瓜离体再生体系，为今后苦瓜遗传转化体系奠定了技术基础。

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