| 标题 | 响应面法在植物组织培养中的应用进展 |
| 范文 | 武爱龙 何冰 吴建阳 周鲜娇 摘 要：目前，植物组织培养的优化策略较多，其中大多数使用单因素试验法或正交试验法研究各因素之间的交互作用，最终得到最优方案。而响应面法（RSM）是采用数学统计方法进行模型拟合并展开优化分析，从而得到最优研究方案。该文从响应面法在初代培养（诱导培养）、继代培养（增殖培养）、生根培养以及其他培养条件中的应用等方面综述了目前响应面法在植物组织培养中的应用现状，并对今后的运用进行了展望，以期为优化植物组织培养过程和实现规模化生产提供参考。 关键词：响应面法;植物组织培养;优化条件;应用展望 中图分类号 Q813.1;TB115.2? 文献标识码 A文章编号 1007-7731（2020）17-0021-03 植物组织培养是一种快速繁殖技术，其理论基础是植物细胞全能性[1]。该技术就是通过从植物上分离细胞、组织、器官或者原生质体，在无菌环境下进行接种，然后将其放置在含有植物激素和营养成分的培养基中生长，从而得到完整的植物[2]。目前，植物组织培养在医药、园艺和农林等行业中得到广泛应用，并取得了一定的效益，特别是在栽培無病毒植物、改良作物品种等方面取得了显著成效。 目前，统计学的应用越来越广泛，其中响应面试验法（Response Surface Methodology，RSM）是以数理统计为基础的一种模拟分析方式，正被越来越多的学者开始关注[3]。RSM设计试验的方法有中心组合设计、全因素设计、Box-Behnken设计等。相对于传统统计方法，RSM法能通过图形更直观地判断优区域;它利用前期试验结果，对有限次数的试验进行合理设计，建立数学模型，拟合出函数的全局关系式，通过描述响应值与各因素间的关系，对试验进行评价与优化，得到最佳试验条件模型;RSM法具有试验次数少、周期短、更直观、精确度高等特点[4]。因此，响应面法在医学、生物、化学等行业，以及生态学、工程学、生化提取工艺等领域的应用越来越广泛 [5]。但是响应面法在植物组织培养中的应用并不是很多，因此有必要对响应面法在植物组织培养中的应用进展进行总结。 1 响应面法在植物组织培养中应用优势 响应面法是一种优化方法，将数学建模应用于综合试验设计中，然后选择一些极具代表性的各点展开试验，在全局范围内对各因素和响应值之间的函数关系进行回归模拟，从而得到各因素的最佳值。与正常的正交设计相比，响应面法对各因素间的交互作用进行了分析，能够从整体上反映各因素的水平效果。目前，优化培养条件的主要方式有响应面法、正交试验法、单因素试验法等。 单因素试验法通常用于确定单个因素的范围，分析较容易，获得的结果也更加直观，但是这种试验法忽视了各组分间的关系，甚至会导致最适宜的条件被忽视。正交试验法涉及到多个因素，但只能分析孤立试验点，无法确定整个区域因素和响应值之间的函数表达式。响应面法主要是利用二次回归模型对各因素和响应值之间的关系进行分析和拟合，试验精度高、次数少、周期短，克服了正交试验的不足，能够得到离散水平的最佳组合[6]，以及整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。最终可以反映出每个因素的变化趋势，得到在全部因素影响下的最佳工作条件，从而提高参数组合的准确性;且试验次数少，节省了时间和成本，避免原料浪费。近年来，响应面法在食品学、生态学等领域得到广泛应用[7]，因其操作简单、可预测性较高，近年来逐渐在植物组织培养研究中得到应用[8]。 2 响应面法在植物组织培养中应用 2.1 初代培养（诱导培养） 初代培养是指直接从机体提取细胞、组织和器官后立即进行培养。初代培养的主要目的是进行无性繁殖系，从而得到无菌材料。在进行初代培养时，通常会使用分化培养基或者诱导培养基，这类培养基中的生长素含量较低，细胞分裂素含量较高。Abbasi等[9]通过响应面法得到了大豆愈合组织诱导和分化的最佳培养基激素配比。Bagherieh 等[10]在研究滇紫草愈伤组织的继代培养基时也使用了响应面法。刘一霏等[11]在愈伤组织初代诱导中采用响应面法将6-BA、2，4-D、NAA设置17种不同的浓度梯度，获得大苞萱草愈伤组织最佳诱导培养基为MS+6-BA（2mg/L）+NAA（0.3mg/L）+2，4-D（0.3mg/L）。江林娟等[12]在研究马铃薯愈伤组织芽分化率时，使用了响应面法优化生长调节剂水平，得到了最优值，即TDZ、2，4-D、GA3分化培养基浓度配比为2.02、0.08、2.25mg/L。 2.2 继代培养（增殖培养） 继代培养是在外植体接种一段时间后，重新切割得到的愈伤组织，转接到新的培养基上，以进一步扩大培养。为达到预定的苗株数量，通常需要经过多次的循环繁殖操作，因此继代培养也称之为增殖培养。其目的就在于在初代培养的基础上进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。张艳萍等[13]以野生白刺的无菌苗幼嫩茎段为外植体，利用响应面法对白刺茎段增殖诱导试验进行优化。采用2因素5水平的响应面法对挑选出的6-BA和IBA 2个因素浓度进行优化，最终得到增殖诱导的最佳培养基配方是MS+6-BA（0.22mg/L）+IBA（0.55mg/L）;培养基进行优化后，同单因素试验相比，前者的增殖系数从3.63提高到3.90。姚思扬等[14]以草莓品种红颜继代组培苗为试验材料，利用响应面法对其增殖条件进行优化。以琼脂浓度、光照度、pH为试验因子，以增殖系数为响应值，进行3因素3水平的试验设计，进而得出红颜草莓增殖条件的优化结果：琼脂浓度7.1g/L，pH 5.37，光照度为2177Lx;在此条件下，最佳增殖系数预测值为10.9305，实际操作结果为10.73。谢勇武等[15]采用南靖金线莲为组培材料，以金线莲接种 60d后鲜植株增殖倍数为评价指标，在研究培养基中各单因素对金线莲鲜植株增殖影响的基础上，再利用响应面法优化金线莲培养基，利用回归模型进行预测，从而得到最佳工艺条件为生长素NAA 0.55mg/L、细胞分裂素6-BA 2.5mg/L、蔗糖38g/L、基本培养基MS添加倍数为1/2。 2.3 生根培养 植物材料增殖数量达到一定值时，须将一部分培养物分流到生根培养阶段，若不能及时转移，将会导致苗子老化、发黄，甚至由于过于拥挤，导致无效苗数量增加，造成浪费。植物组织培养是否成活与生根壮苗密切相关。彭文书等[16]以单因素试验为基础，使用Plackett-Burman 设计等方式得到了影响铁皮石斛生根培养基条件最重要的因素分别是NAA浓度、6-BA 浓度、香蕉泥量以及马铃薯量;同时，利用回归方程得到这4个因素的最佳浓度值，香蕉泥87.63g、马铃薯89.30g、NAA最优浓度0.52mg/L、6-BA最优浓度0.24mg/L。董燕婧等[17]使用Design-Expert8.0对回归方程进行计算，得到适应白芨幼苗生长的最佳培养基的最佳配方为：蔗糖30g/L、香蕉汁100g/L、活性炭0.6g/L、马铃薯汁50g/L、6-BA 2.0mg/L、琼脂7g/L、NAA 0.2mg/L、MS;这种条件下能够得到5.3条白芨幼苗根，平均根长1.6cm，平均根粗1.19mm。 2.4 其他培养条件 目前，常规的组培快繁体系环节较多，主要有接种外植体、初代和继代培养，同时还受到其他培养条件的影响。在使用响应面法进行单因素预试验时，需要确保其条件为最佳设计，从而为自变量变化和组培苗成活率两者之间的关系构建相应的模型，并展开综合分析，最终得到优化方案以对各项因素进行试验[18]。李雪雪等[19]以单因素试验结果作为基础构建相应曲面模型，并选择光照时间、氯化汞消毒时间和天然营养物质浓度作为自变量，以葡萄微嫁接苗的成活率为响应值进行响应面分析。结果显示，当光照时间为16.92h、氯化汞消毒时间是7.11min、香蕉泥浓度697.09mg/L时，葡萄微嫁接苗成活率最高;为提高操作方便性，以最佳试验条件作为基础，设定氯化汞消毒7.1min、光照时间17h、香蕉泥浓度700mg/L，葡萄微嫁接苗的成活率大概在65.2±0.8%，这充分说明响应面法能够对葡萄微嫁接组培快繁技术体系进行优化。詹杏熔等[20]使用响应面法构建模型对组培金线莲单瓶产量进行预测，最终得到了最佳培养基配方：蔗糖浓度2.89%、蘑菇预煮液浓度0.68%、0.53倍的MS基本培养基，最佳配方得到的金线莲单瓶产量远远高于对照组，这充分表明蘑菇预煮液可以视为天然有机生长调节剂。 3 响应面法在植物组织培养的应用展望 响应面法可以在初代培养（诱导培养）、继代培养（增殖培养）、生根培养等操作过程中对试验设计和条件进行优化，得到整个区域所有因素的响应值和最佳组合的最佳值。响应面法是对培养条件进行优化、提高愈伤组织芽分化率和增殖系数、壮苗生根、提高组培苗某些活性成分等的一种有效方法。与正交试验相比，响应面法具有更高的准确度，能够实现规模化生产，提高工业化水平。 目前，响应面法软件由Design Expert 8升级到Design Expert 10版本，操作更加简便，功能更加强大，使用更加高效，尤其是可以利用二次多项式在验算点附近使用响应面函数来同真实功能函数进行拟合。蒋水华[21]对功能函数方法进行拟合，对各项精度和效率进行计算，从而从整体上系统分析响应面。研究发现，在使用随机响应面时，可以和高阶随机多项式相配合，从而提高其同真实功能函数的拟合度，更加准确地得到最佳培养条件。由此可见，响应面法在植物组织培养中的应用将会越来越广泛。 参考文献 [1]李焕明.景观植物在园林造景中的应用[J].农业与技术，2013，33（3）：115，117. 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