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超高效液相色谱-串联质谱对香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺农药残留的检测

范文

赵小云谢德芳

摘要：分散固相萃取（QuEChERS）为样品前处理方法，建立超高效液相色谱-串联质谱同时检测香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺农药残留的分析方法。样品经乙腈提取，N-丙基乙二胺净化，超高效液相色谱分离，电喷雾电离、正负离子扫描，单四极杆串联质谱以多反应监测扫描方式对样品进行检测，采用基质匹配标准品外标法进行定量分析。结果表明，苯醚甲环唑和噻呋酰胺在0.05～0.50 μg/L时呈良好的线性关系，基质标准曲线分别为y=3.17×104x+1.18×106（r=0.999 4）、y=6.04×103x+8.3×105（r=0.999 3）。在0.1、1.0、10.0 mg/kg 3个添加水平下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的平均回收率分别为94.9%～107.5%、93.6%～102.3%;相对标准偏差分别为7.2%～9.0%、3.2%～9.3%;苯醚甲环唑的检出限和定量限分别为1.0、3.3 μg/kg，噻呋酰胺的检出限和定量限分别为0.5、3.3 μg/kg。樣品经测定，发现不套袋处理下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的半衰期分别为11.0、14.7 d;套袋前施药，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的半衰期分别为23.1、16.1 d;2种农药的安全间隔期都是35 d。

关键词：苯醚甲环唑;噻呋酰胺;高效液相色谱-串联质谱;香蕉;农残检测

中图分类号： S482.2;TQ450.2+63 ?文献标志码： A ?文章编号：1002-1302（2019）02-0181-05

苯醚甲环唑和噻呋酰胺都是新型的广谱、低毒、内吸性强、环境友好型的高效杀菌剂[1-3]，对真菌引起的叶斑病、炭疽病和立枯病等有较好的治疗和防治作用[4-6]，是防治香蕉叶斑病的主要农药品种。

目前已报到的苯醚甲环唑的检测方法有气相色谱-电子捕获检测器（GC-ECD）[7]、表面增强拉曼光谱的快速检测[8]、直接酶联免疫[9]、气相色谱-串联质谱[10-11]、超高效液相色谱-串联质谱[12-14]等，噻呋酰胺的检测方法有高效液相色谱[15]、GC-ECD[16]、气相色谱-离子阱质谱[17]、超高效液相色谱-串联质谱[18]等。但同时检测这2种农药的方法还未见报道，其中气相色谱检测时间较长，不适合大量样品的使用，拉曼光谱和酶联免疫等快速检测技术的灵敏度较低，尚不能普遍使用。

随着串联质谱的发展，超高效液相色谱-串联质谱也越来越多地出现在农药残留分析中，其具有灵敏度高、检测时间短、准确度高等特点。农药前处理方法使用最广的当属分散固相萃取（QuEChERS），因其具有快速、简单、廉价、有效、可靠及安全的特点，成为国内外的研究热点，QuEChERS起初是高水分含量的果蔬中农药残留分析的前处理方法，后来在固相微萃取和盐溶缓冲的提取和净化过程中得到应用，现可以用在大量样品的广谱分析中。林涛等使用QuEChERS前处理方法和超高效液相色谱-串联质谱技术测定蔬菜中的41种农药残留，检出限为0.003～1.000 μg/kg，该方法的回收率为74.1%～120.4%，相对标准偏差为2.8%～11.9%，该方法快速、简便、灵敏度高、净化效果好[18]。王连珠等采用QuEChERS-液相色谱-串联质谱技术测定蔬菜中66种有机磷农药的残留量，该方法的回收率为55%～122%，相对标准偏差为1.6%～18.0%，定量限为0.1～8.0 μg/kg，该方法灵敏简便，符合法规残留限量检测要求[19]。

本研究采用QuEChERS为样品前处理方法，建立超高效液相色谱-串联质谱检测方法同时对香蕉中的苯醚甲环唑和噻呋酰胺进行检测，以期为农药残留检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国AB SCIEX公司生产）;多管漩涡混合器（北京优晟联合科技有限公司生产）;电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产];落地式高速冷冻离心机（赛默公司生产）;涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂生产）;有机相针式滤器（尼龙）（13 mm，0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司生产）;一次性使用无菌注射器（江西宏达医疗器械集团有限公司生产）;氮吹仪（杭州德克尔实验设备有限公司生产）;色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm，Waters公司生产）。

甲醇[赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产]，分析纯;乙腈[赛默飞世尔科技（中国）有限公司生产];氯化钠（广州化学试剂厂生产）;C18、石墨化碳（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（美国安捷伦公司生产）;噻呋酰胺标准品、苯醚甲环唑标准品（阿拉丁公司生产）。

1.2 田间试验

试验时间：2017年2月22日至5月12日。试验地点：海南省海口市中国热带农业科学院分析测试中心试验基地。试验药剂：27.8%噻呋酰胺·苯醚甲环唑悬浮剂（噻呋酰胺含量为13.9%、苯醚甲环唑含量为13.9%）。试验作物：香蕉。施药时期及施药方法：果实半大时，在果实不套袋、套袋前、套袋后整株喷施药剂。样品的采集与制备：采样距施药间隔期分别为0、1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d。按照试验设计时间要求，以随机方法用小刀在试验香蕉树不同方向及上、中、下等不同部位采集7～8条（不少于2 kg）生长正常、无病害、施药时确定已着药的香蕉，装入塑料袋中包扎妥当，并贴上标签。将采集的样品切碎，匀浆装袋，贴上标签后于-20 ℃冰柜中冷冻保存，待测。

1.3 样品前处理方法

准确称取10.0 g香蕉样品于50 mL离心管中，加入 20 mL 乙腈，匀浆2 min，涡旋2 min提取，以8 000 r/min离心5 min;取全部上清液于加入10 g氯化钠的离心管中，涡旋 1 min，以8 000 r/min离心5 min;取10 mL上清液于含PSA和无水硫酸镁的离心管中，涡旋1 min后，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机膜，待进样。

1.4 净化剂优化方法

本试验采用QuEChERS为样品前处理方法，对常用的净化剂PSA、GCB和C18进行选择。3种净化剂可有效除去样品中的脂肪酸、色素、甾醇类等物质[20]。本试验以 0.1 mg/kg 为添加水平，对比分析3种净化剂对苯醚甲环唑和噻呋酰胺的回收率。

1.5 基质标准溶液的配制和基质效应测定

精确称取0.010 0 g苯醚甲环唑和噻呋酰胺（99.8%）标准品（精确至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成浓度为100 μg/mL的储备液，于4 ℃冰箱中保存。准确移取适量储备液，分别用甲醇稀释成10.00、5.00、1.00、0.10、0.05 μg/mL系列浓度的标准品溶液。按照“1.2”节中所述的方法，对空白香蕉样品进行处理，取一定体积的适量浓度标准溶液，加入2 mL的容量瓶中，氮气吹干，加处理过的空白香蕉基质，配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL基質标准溶液，过0. 22 μm有机膜，待进样。本研究采用相对响应值法：基质效应=空白基质标准响应值/纯溶剂标准响应值，基质效应>1时，表现为基质增强效应;基质效应<1时，表现为基质抑制效应。

1.6 色谱-质谱条件

1.6.1 色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）;柱温为40 ℃;进样量为 0.25 μL。色谱洗脱条件见表1。

1.6.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源;扫描模式为正、负离子扫描;离子源气体1（GS1）为344.5 kPa，离子源气体2（GS2）为344.5 kPa;离子喷雾电压为5 500 V;气帘气为 137.8 kPa;离子源温度为600 ℃。检测方式为多重反应监测。其他质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 试验条件的优化

2.1.1 提取剂的优化本试验对比分析了3种常用提取剂丙酮、乙酸乙酯和乙腈的提取效果，丙酮和乙酸乙酯易挥发，并且提取物中会有较多的其他成分，容易产生基质干扰[21]。香蕉具有较大的黏性，用乙腈作为提取剂，可以大大减少香蕉样品基质中蜡质、脂肪和一些亲脂性色素的提取量，并且乙腈对各种农药均有较好的提取效果[22]。因此本试验选择乙腈作为提取剂。

2.1.2 净化剂的优化由表3可知，使用PSA、GCB、C18做净化剂，苯醚甲环唑回收率的平均值分别为104.2%、91.2%、96.2%。相对标准偏差分别为8.5%、8.2%、3.5%，3种净化剂对苯醚甲环唑都有较好的回收率，都能满足试验要求。以PSA、GCB、C18做净化剂，对噻呋酰胺回收率的平均值分别为94.1%、117.3%、104.3%，相对标准偏差分别为9.2%、15.5%、15.8%，PSA净化剂对噻呋酰胺的回收率和相对标准偏差能满足要求，GCB对噻呋酰胺的回收率为117.3%，可见对溶剂有一定的吸收，回收率偏高，且相对标准偏差大于10%，不满足试验要求，C18的相对标准偏差也不达标。因此综合来看，本试验使用PSA做净化剂能同时对苯醚甲环唑和噻呋酰胺有较好的回收率，且能满足试验要求。

2.1.3 质谱条件优化本试验通过对影响定量离子响应度和灵敏度的关键质谱参数去簇电压和碰撞能量进行优化，苯醚甲环唑和噻呋酰胺最优去簇电压和碰撞能量分别为 138.0 V、35.0 eV和-96.0 V、-28.9 eV。

2.1.4 色谱条件优化色谱柱的选择：苯醚甲环唑和噻呋酰胺是极性较强的化合物，适合采用反相色谱分离，本试验采用ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）色谱柱具有较好的分离效果。流动相组成、比例和流速的选择：使用0.1%甲酸溶液，相比超纯水，甲醇溶液具有较高的灵敏度。按照“1.6.1”中的梯度洗脱条件，目标物具有较好的保留时间、峰形和和分离效果。优化条件下的色谱图如图1、图2所示。

2.2 基质效应

在超高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析中，基质效应是影响定量分析结果最重要的因素之一[23]。基质效应可导致目标分析物信号的增强或减弱，从而使分析结果不可靠。

由表4可知，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的基质效应均小于1，表现为基质抑制效应，且低浓度时基质抑制效应较大;浓度越高，基质抑制效应整体越弱。因此试验采用基质匹配标准溶液校正方法对基质效应进行补偿，以降低基质效应的干扰。

2.3 标准曲线和线性范围

将 0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL系列浓度的苯醚甲环唑和噻呋酰胺标准溶液和香蕉基质标准溶液在“1.5”节所述的条件下进样，以其峰面积（y）和相应标准样品浓度（x）作标准曲线。苯醚甲环唑的基质标准曲线为y=3.17×104x+1.18×106（r=0.999 4）;噻呋酰胺的基质标准曲线为y=6.04×103x+8.3×105（r=0.999 3）。

2.4 方法的准确度、精密度

在空白香蕉中分别进行0.1、1.0、10.0 mg/kg 3个水平的加标回收试验，每个水平重复测定5次，计算加标回收率和相对标准偏差。由表5可知，在0.1、1.0、10.0 mg/kg 3个添加水平下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的平均回收率分别为94.9%～107.5%、93.6%～102.3%，相对标准偏差分别为7.2%～9.0%、3.2%～9.3%，方法显示出良好的准确度和精密度，可以满足试剂样品中农药残留的检测要求。

2.5 方法的检出限和定量限

检出限是指使检测系统产生3倍噪音信号所需待测物的浓度或质量（3倍信噪比计算）。定量限是指使用添加方法能检测出待测物在样品中的最低含量（10倍信噪比计算）。分别以0.01、0.02 mg/kg添加水平的色谱图进行衡量，得到苯醚甲环唑的检出限和定量限分别为1.0、3.3 μg/kg，噻呋酰胺的检出限和定量限分别为0.5、3.3 μg/kg。如图3、图4所示。

2.6 样品检测结果与分析

2.6.1 苯醚甲环唑和噻呋酰胺的消解动态分析由表6可知，不套袋施药，苯醚甲环唑在香蕉中消解的一级热力学方程为C=2.024 9e-0.063 0t（R2=0.953 4），半衰期=11.0 d;套袋前施药，苯醚甲环唑在香蕉中消解的一级热力学方程为 C=1.152 4e-0.030 0t （R2 = 0.853 6），半衰期=23.1 d。由表7可知，不套袋处理下，噻呋酰胺在香蕉中的消解的一级热力学方程为方C=1.459 3e-0.047 0t（R2=0.935 6），半衰期=14.7 d;套袋前施药，噻呋酰胺在香蕉中的消解的一级热力学方程为C= 2.050 6e-0.040 0t（R2=0.879 4），半衰期=16.1 d。

2.6.2 苯醚甲环唑和噻呋酰胺最终残留分析对香蕉样品进行检测，得到苯醚甲环唑和噻呋酰胺的最终残留数据（表8）。在35 d时，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的最终残留量均小于其最大残留限量（1 mg/kg）。因此安全间隔期均为35 d。

3 结论

本研究通过对样品前处理方法、质谱条件和色谱条件的优化，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同时测定香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺残留量的分析方法，该方法前处理简单、快速、回收率高，方法的灵敏度、准确度和精密度等均满足农药残留分析的要求，适用于大量样品的快速检测。

通过对香蕉样品进行检测，得到苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的消解动态和最终残留数据，不套袋处理下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的半衰期分别为11.0、14.7 d，套袋前施药，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的半衰期分别为23.1、16.1 d，2种农药的安全间隔期都是35 d。

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