| 标题 | 套袋微环境对香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺内吸性和降解速率的影响及机制 |
| 范文 | 赵小云 谢德芳 田海 摘要：通过对不套袋施药、套袋后施药和套袋前施药3种施药方式下的香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺残留量进行分析，并对袋内外光温度、湿度和光照等环境因子进行监测，探讨套内温度、湿度和光照等环境因子的变化对苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸作用和降解速率的影响，并就其机制进行分析。结果表明，套袋后，袋内可形成高温、高湿和弱光的特殊环境条件;与不套袋相比，套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸作用受到抑制，导致其在香蕉中的内吸量降低;袋内高温、高湿和弱光的特殊环境可降低植物的蒸腾作用，使苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中传导和吸收的量受阻，从而降低了2种农药在香蕉中的内吸量;与不套袋相比，套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率减慢;袋内高温、高湿和弱光的特殊环境可降低植物的蒸腾作用和有关酶的活性，可使苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的代谢降解受到抑制，使其降解速率减慢，并且在微环境条件下，对不同种类的农药抑制作用不同，对苯醚甲环唑的降解影响较大，对噻呋酰胺的抑制影响较小。 关键词：套袋微环境;香蕉;苯醚甲环唑;噻呋酰胺;内吸作用;降解速率;影响机制 中图分类号： S668.101;S481+.8? 文献标志码： A? 文章编号：1002-1302（2019）03-0154-05 苯醚甲环唑和噻呋酰胺都是新型、高效、广谱、低毒、内吸性强、环境友好的杀菌剂[1-3]，对真菌引起的叶斑病、炭疽病和立枯病等疾病有着较好的治疗和防护作用[4-6]，是防治香蕉叶斑病的主要农药品种。果实套袋已成为我国果树生产的一项重要栽培技术，其应用几乎覆盖所有果树品种[7]，香蕉套袋技术目前已经被普遍运用。目前，对套袋后的袋内光照、温度和湿度等特殊微环境的变化已有不少研究，如李云昌等研究了套袋对荔枝果穗微环境光照、温度的影响[8];王磊等研究了套袋对番茄果实微环境的影响[9]。而套袋微环境对果蔬的影响多集中于对果蔬品质的影响，其中包括对糖类物质[10]、色素[11]、矿物质[12]等的影响，而套袋微环境的变化对果蔬中农药内吸作用和降解速率的影响和机制研究鲜有报道。本研究通过对不套袋施药、套袋后施药和套袋前施药3种施药方式下香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺的降解动态进行对比分析，同时对袋内外温度、湿度和光照等环境因子的变化进行监测，旨在探讨袋内微环境对香蕉中苯醚甲环唑和噻呋酰胺内吸作用和降解速率的影响。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国爱博才思公司）;多管漩涡混合器（北京优晟联合科技有限公司）;电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司];落地式高速冷冻离心机[赛默飞世尔科技（中国）有限公司];涡旋混合器（上海青浦沪西仪器厂）;有机相针式滤器（尼龙，13 mm，0.22 μm）（上海安谱实验科技股份有限公司）;一次性使用无菌注射器（江西宏达医疗器械集团有限公司）;氮吹仪（杭州德克尔仪器设备公司）;色谱柱ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1×50 mm，美国沃特世公司）。 甲醇、乙腈[赛默飞世尔科技（中国）有限公司];氯化钠（广州化学试剂厂）;十八烷基硅烷键合硅胶（C18）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）（安捷伦科技有限公司）;噻呋酰胺标准品;苯醚甲环唑标准品。 1.2 田间试验 试验时间为2017年2月22日至5月12日。试验地点为海南省海口市中国热带农业科学院分析测试中心实验基地。试验药剂为27.8%噻呋酰胺·苯醚甲环唑悬浮剂（有效成分1及其含量：噻呋酰胺13.9%;有效成分2及其含量：苯醚甲环唑13.9%）。试验作物为香蕉。 试验方法：27.8%噻呋酰胺·苯醚甲环唑悬浮剂在香蕉上防治叶斑病的最高推荐使用剂量为417 mg a.i./kg（试剂与水的体积比为1 ∶ 667），施药方式为全株喷雾，施药次数为1次。试验小区有6棵香蕉，试验重复2次。 施药时期及施药方法：果实半大时;果实不套袋、套袋前、套袋后整株喷。另设不施药处理，采对照样。 样品的采集与制备：采样距施药时间为0 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d、49 d。按照试验设计时间要求，以随机的方法用小刀在试验香蕉树不同方向及上、中、下不同部位采集7～8条（不少于2 kg）生长正常、无病害、成功施药的香蕉个体，装入塑料袋中包扎妥当，并贴上标签。将采集的样品切碎，匀浆装袋，贴上标签后于-20 ℃冰柜中冷冻保存，待测。 使用湿度计、温度计和光照度计对田间湿度、温度和光照数据进行采集。 1.3 样品前处理方法 准确称取10.0 g香蕉样品于50 mL离心管中，加入 20 mL 乙腈，匀浆2 min，涡旋2 min提取，转速为8 000 r/min离心5 min;取全部上清液于已加入10 g氯化钠的离心管中，涡旋 1 min，以8 000 r/min离心5 min;取上清液10 mL于含PSA和无水硫酸镁的离心管中，涡旋1 min后，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm有机膜，待进样。 1.4 基质标准溶液的配制 精确称取苯醚甲环唑和噻呋酰胺（99.8%）标准品 0.010 0 g（精确至0.000 1 g），用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成浓度为100 μg/mL的储备液，于4 ℃冰箱中保存。准确移取适量储备液，分別用甲醇稀释成10.00、5.00、1.00、0.10、0.05 μg/mL系列浓度的标准品溶液。按照“1.3”节中所述方法，对空白香蕉样品进行处理，取适量浓度一定体积的标准溶液，加入2 mL体积的容量瓶中，氮气吹干，加处理过的空白香蕉基质，配制成0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL基质标准溶液，过0.22 μm有机膜，待进样。 1.5 色谱-质谱条件 1.5.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（2.1×50 mm，1.7 μm），柱温为40 ℃，进样量为0.25 μL，梯度洗脱条件详见表1。 1.5.2 质谱条件 离子源为电喷雾离子源（ESI）;扫描模式为正、负离子扫描;离子源气体GS1：0.344 75 MPa，离子源气体GS2：0.344 75 MPa;离子喷雾电压为5 500 V;气帘气：0.137 90 MPa;离子源温度为600 ℃。检测方式为多重反应监测（MRM）。其他质谱参数见表2。 2 结果与分析 2.1 优化条件下苯醚甲环唑和噻呋酰胺标准溶液色谱 优化条件下苯醚甲环唑和噻呋酰胺标准溶液色谱分别见图1、图2。 2.2 标准曲线和线性范围 将0.05、0.10、0.20、0.30、0.50 μg/mL系列浓度的苯醚甲环唑和噻呋酰胺标准溶液和香蕉基质标准溶液在“1.5”中的条件下进样，以其峰面积（y）对相应标准样品浓度（x）作标准曲线。苯醚甲环唑的基质标准曲线为y=3.17×104x+118×106（r=0.999 4）;噻呋酰胺的基质标准曲线为y=604×103x+8.3×105（r=0.999 3）。 2.3 方法的准确度、精密度 在空白香蕉中分别进行0.10、1.00、10.00 mg/kg 3个水平的加标回收试验，每个水平重复测定5次，计算加标回收率和相对标准偏差。在0.10、1.00、10.00 mg/kg 3个添加水平下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的平均回收率分别为94.9%～107.5%和93.6%～102.3%，相对标准偏差分别为7.2%～9.0%和3.2%～9.3%，方法显示了良好的准确度和精密度，可满足试剂样品中农药残留检测的要求，结果见表3。 2.4 方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ） 检出限和定量限分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算。分别以0.01、0.02 mg/kg添加水平的色谱图进行衡量，得到苯醚甲环唑和噻呋酰胺的检出限和定量限分别为 1.0、3.3 μg/kg 和0.5、3.3 μg/kg。 2.5 苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸作用 苯醚甲环唑在香蕉中的消解动态见图3，3种施药方式下，苯醚甲环唑在香蕉中的残留量都先升高后降低，并在3 d后其残留量达到最大值，表明苯醚甲环唑有较强的内吸性，可通过茎、叶等部位传导到果实部位，使其残留量升高;不套袋施药、套袋前施药和套袋后施药3种施药方式下，苯醚甲环唑在香蕉中因内吸作用而增加的农药量依次为0.54、0.26、0.08 mg/kg，由此可得不套袋施药苯醚甲环唑在香蕉中的内吸量高于套袋前施药和套袋后施药。 噻呋酰胺在香蕉中的消解动态见图4，不套袋施药、套袋前施药和套袋后施药3种方式下，噻呋酰胺的残留量都表现为先升高后降低的趋势，表明噻呋酰胺在香蕉中具有较强的内吸性。此外，不套袋施药、套袋前施药和套袋后施药3种处理下，噻呋酰胺在香蕉中因内吸作用而增加的农药量依次为0.33、0.20、0.11 mg/kg，同样可得不套袋处理下，噻呋酰胺的内吸量较套袋处理下的内吸量高。 试验表明，不套袋处理下，苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸量较套袋处理高，袋内的微环境条件可能会抑制2种农药的内吸作用，使其内吸量低于不套袋处理。 2.6 苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中消解速率 苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的消解曲线如图5和图6所示。 不套袋施药，苯醚甲环唑在香蕉中消解的一级热力学方程为C=2.024 9e-0.063t（R2=0.953 4），半衰期T1/2=11.0 d;套袋前施药，苯醚甲环唑在香蕉中消解的一级热力学方程为C=1.152 4e-0.030t（R2=0.853 6），半衰期T1/2=23.1 d。不套袋方式下苯醚甲环唑在香蕉中的消解半衰期小于套袋方式下苯醚甲环唑在香蕉中的半衰期。表明套袋后苯醚甲环唑的消解速率减慢。 不套袋处理下，噻呋酰胺在香蕉中的消解方程为C=1.459 3e-0.047t，R2=0.935 6，半衰期T1/2=14.7 d;套袋前施药，噻呋酰胺在香蕉中的消解方程为C=2.050 6e-0.043t，R2=0.879 4，半衰期T1/2=16.1 d。不套袋处理下，噻呋酰胺在香蕉中的半衰期小于套袋处理，表明套袋处理可降低噻呋酰胺在香蕉中的消解速率。 试验表明，套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率都减慢。 不套袋施药，苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中消解半衰期分别为11.0、23.1 d;套袋前施药，苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中消解半衰期分别为14.7、16.1 d，套袋处理与不套袋处理，苯醚甲环唑和噻呋酰胺的半衰期分别延长12.1 d和 1.4 d。说明套袋处理对苯醚甲环唑和噻呋酰胺的降解都有一定的抑制作用，但抑制作用的强弱不同，对苯醚甲环唑降解的抑制作用较大，对噻呋酰胺降解的抑制作用较小。说明袋内的微环境对不同种农药的降解速率影响不同。 2.7 袋内外温度、湿度和光照变化数据 2.7.1 袋内外温度变化趋势 袋内、外温度变化曲线分别见图7、图8。 袋外温度最大值为37.6 ℃，最小值为15.4 ℃，平均值为25.3 ℃，极值为22.2 ℃;袋内温度最大值为38.7 ℃，最小值为17.6 ℃，平均值为26.4 ℃，极值为21.1 ℃。袋内温度比袋外平均温度高1.1 ℃，一般看来，温度变化趋势为18：00至次日07：00温度逐渐降低，07：00至18：00温度逐渐升高，在14：00至16：00溫度达到最高，变化趋势呈峰型，白天温度高，夜间温度低。这与陈俊伟等的试验研究结果[13-14]一致。 2.7.2 袋内外湿度变化趋势 袋内外湿度变化曲线见图9、图10。袋内相对湿度（RH）最大值为100%，最小值为569%，平均值为93.0%;袋外相对湿度最大值为100%，最小值为39.3%，平均值为83.5%。袋内平均相对湿度比袋外高9.5%，一般看来，湿度变化趋势为20：00至次日08：00湿度逐渐升高，24：00至次日 04：00 湿度达到最大值，接近100%，在08：00至20：00湿度逐渐下降，这与温度的变化趋势正好相反。随温度的升高，湿度降低。这与张斌斌等的试验结果[15-16]一致。此外发现果实套袋以后，由于果袋透气性差，果实袋内环境与果实袋外环境热量交换受阻，导致袋内温度高，湿度大，形成了独特的微域环境[17]。 2.7.3 袋内外光照变化趋势 使用照度计对田间香蕉袋内外的光照强度进行测量，结果见表4。由表4可以看出，袋内的光照远低于袋外光照，形成弱光环境。大多数套袋为果实提供了一个较高温、高湿、弱光的微域环境[18]。 2.7.4 套袋微环境对苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中内吸性和降解影响的机制 温度、湿度和光照等环境因素与农药残留、农药吸附和农药降解关系密切[19]，药剂在植物体内的传导速度和输导量受其蒸腾速度和气候因子等影响[20-21]。果实套袋改变了果实发育过程中的光照、 温度、湿度、气体等微环境条件，从而影响植物蒸腾作用，对果实中农药代谢降解等生理过程产生了复杂的影响[22-23]。光照对蒸腾作用影响最大，因此对农药的吸收影响最大，弱光不利于农药的吸收，温度高不利于农药的吸收，套袋果实处在高湿环境下蒸腾作用较低。袋内形成的高温环境和弱光环境降低了果实的蒸腾作用，还影响果实内各种酶活性[24-25]，因此生长在纸袋微域环境中的果实能降低农药在果实中的残留量和降解速率[26]。 套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸量都降低，袋内微环境可能会抑制2种农药的内吸作用，使其内吸量低于不套袋处理。这是由于套袋后袋内的高温、高湿和弱光环境降低了香蕉果实的蒸腾作用，2种农药在果实中的吸收和传导量降低，从而使其内吸量低于不套袋处理。 套袋后，苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率都降低。这是由于套袋后，袋内形成的高温、高湿和弱光环境降低了香蕉果实的蒸腾作用，从而降低了农药的代谢与降解，导致降解速率减慢。 3 结论 套袋后，袋内形成了高温、高湿和弱光的特殊环境条件。与不套袋相比，套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的内吸作用受到抑制，导致其在香蕉中的内吸量降低;袋内高温、高湿和弱光的特殊环境可降低植物的蒸腾作用，使苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的传导和吸收受阻，从而降低了药剂在香蕉中的最高残留量。与不套袋相比，套袋后苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的降解速率减慢;袋内高温、高湿和弱光的特殊环境可降低植物的蒸腾作用和有关酶的活性，使苯醚甲环唑和噻呋酰胺在香蕉中的代谢降解受到抑制，因而药剂的降解速率降低，并且，对不同的药剂作用效果不同，对苯醚甲环唑的降解抑制较大，对噻呋酰胺的影响较小。 参考文献： [1]谢吉先，丁国祥，何建国，等. 噻呋酰胺悬浮剂对花生白娟病的防效[J]. 安徽农业科学，2015，43（24）：95-96. 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