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不同消毒剂对规模化养羊场舍内空气细菌的影响

范文

钟纯燕　郝飞　李文良　毛立　主性　嵇辛勤　江杰元　李基棕　刘茂军

摘要：为筛选出最佳消毒剂以降低羊舍内空气细菌含量，采用规模养羊场常用的4种消毒剂进行消毒效果试验，在消毒前后测定羊舍内空气中细菌总数，并对优势菌落进行PCR鉴定。结果显示，不同种类的消毒剂杀菌效果有差异，其中戊二醛溶液的杀菌率为42.8%，戊二醛癸甲溴铵溶液杀菌率为58.6%，溴氯海因杀菌率为76.5%，聚维酮碘杀菌率为44.5%，因此溴氯海因杀菌效果最佳;PCR扩增测序结果表明，羊舍内空气细菌主要有芽孢杆菌、葡萄球菌、志贺氏菌、不动杆菌、奥斯陆莫拉菌、希氏肠球菌和胚芽乳杆菌等，这些细菌的16S rRNA序列与GenBank收录的参考序列同源性达98.0%以上。本研究为规模养羊场细菌性疾病的预防与控制提供参考数据。

关键词：规模化养羊场;消毒剂;细菌计数;PCR鉴定

中图分类号： S826.4+6文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）08-0194-04

近年来，随着养羊业的不断发展，羊群数量不断增加，规模化养羊场逐渐形成。规模化养殖虽然降低了经济成本，但也因为患畜的频繁接触、羊舍通风不良、排泄物堆积等因素导致空气中细菌浓度大大升高，这对羊群健康产生潜在的威胁[1-2]。王振对发病羊的病料进行细菌流行病学调查发现，主要病原菌有链球菌、葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和溶血性曼氏杆菌，动物试验结果显示这些细菌对小白鼠致病力较强[3]。李奕芙研究得出，羊场发病死羊以绿脓杆菌的感染率最高（49.3%），且存在细菌多重感染，其中二重感染率达54.4%[4]。因此，掌握养羊场空气中的细菌数量和种类，是预防和控制养羊场细菌性疾病的先决条件。规模羊场常用喷雾消毒来杀灭羊舍内细菌，但市面上用于羊场细菌消毒的消毒剂种类较多，消毒效果也存在一定差异，选择敏感性消毒剂做好环境消毒亦成为当前净化环境、控制疾病的主要手段[5-6]。

因此，为准确掌握各种消毒剂的杀菌效果，本试验采用喷雾消毒法对规模羊场常用的4种消毒剂进行消毒效果评估，计算消毒后的杀菌率，选择最有效合理的消毒剂，并鉴定其中的优势菌落，以期为消毒剂的选择提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1培养基及试剂

绵羊鲜血琼脂培养基购自杭州微生物试剂有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP、DNA marker等均购自北京全氏金生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2消毒药品

试验使用了4种消毒剂，分别为稀戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴铵溶液、溴氯海因粉和聚维酮碘溶液（表1）。[HJ1.5mm]

1.2试验时间与地点

本试验于2017年11月在江苏省太仓市某湖羊场进行。

1.3采样设计

选择4间羊数、大小、风向相同的羊舍，在每间羊舍内设置6个细菌采集点，1个采集点放置2个绵羊鲜血琼脂平皿，每间羊舍中间设有过道，分别在过道三等分处按图1所示设置6个采集点。

1.4试验方法

1.4.1空气中细菌总数测定

参照中华人民共和国国家标准GB/T 18024.1—2000《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》收集羊舍内空气中的细菌[7]。消毒前后1 h对空气中的细菌进行收集，将绵羊鲜血琼脂平皿开盖放置于羊舍内离地面1.5 m的6个采集点上，暴露于空气中10 min后，盖好平皿盖，标注采集地点、日期及编号，冷藏快速送往实验室置于37 ℃恒温培养箱过夜培养。对平皿上的细菌菌落进行计数，以每平皿菌落数（CFU/m3）报告结果。

1.4.2消毒剂杀菌试验

将戊二醛溶液、戊二醛癸甲溴铵溶液、溴氯海因、聚维酮碘4种消毒剂按说明书上的最适杀菌浓度进行稀释，每种消毒液喷洒消毒1间羊舍，消毒后1 h，利用自然沉降法收集羊舍内空气中的细菌，进行平板计数，计算消毒后的細菌含量和杀菌率[8]。杀菌率=（消毒前菌数-消毒后菌数）/消毒前菌数×100%，从6个细菌采集点的杀菌率求出每种消毒剂的平均杀菌率。

1.4.3优势细菌鉴定

参照丁燕霞等设计的细菌16S rRNA引物[9]（P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;P2：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，预期扩增片段大小约为1 400 bp。选取优势菌落制备细菌染色体DNA模板，PCR反应体系为25.0 μL：Taq DNA聚合酶 0.5 μL，DNA模板2.0 μL，引物P1、P2各1.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 1.0 μL，无菌水17.0 μL。反应程序：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35个循环;72 ℃ 10 min。反应结束后，取PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳检测。将目的片段切胶回收，并与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，经鉴定正确后送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

2结果与分析

2.1羊场舍内空气细菌菌落总数

羊舍内空气中采集到的细菌经过夜培养后，按奥氏公式[10]计算菌落总数：C=50 000N/AT。C表示菌落总数，CFU/m3;N表示每皿菌落数，个;A表示培养皿面积，cm2;T表示采样时间，min。所得菌落总数见表2。

2.2消毒剂杀菌试验

对4间羊舍分别使用4种消毒剂进行喷洒消毒，因消毒剂的种类不同，消毒效果也不同，4种消毒剂的杀菌率见表3，其中以溴氯海因杀菌效果最好。

2.3优势细菌鉴定

2.3.1PCR鉴定结果

将PCR产物在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，得到大小约1 400 bp的特异性条带，与预期结果一致（图2）。测序获取核酸序列，BLAST比对分析发现，主要优势菌包括芽孢杆菌属（枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、土地芽孢杆菌和类芽孢杆菌）、葡萄球菌属（产色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌）、不动杆菌属（不动杆菌和鲁氏不动杆菌）、肠球菌（希氏肠球菌和屎肠球菌）、痢疾志贺氏菌、大肠杆菌、奥斯陆莫拉菌、胚芽乳杆菌等。

2.3.2遗传进化分析

将获取的核酸序列经BLAST比对分析发现，痢疾志贺氏菌、奥斯陆莫拉菌、不动杆菌、屎肠球菌、胚芽乳杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌与GenBank中收录的菌株16S rRNA同源性均达98%以上。用MEGA 5.0绘制遗传进化树得出，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、不动杆菌、胚芽乳杆菌和奥斯陆莫拉菌与GenBank中的参考序列遗传距离均较远;痢疾志贺氏菌与HQ759185.1、KY789442、EU009185.1、KX162657.1等11株菌序列亲缘关系最近;屎肠球菌与KT261031.1、KT261082.1亲缘关系最近;枯草芽孢杆菌与CP024649、CP017682、AP018349.1、AP017891.1亲缘关系最近，共同组成一组微小分支（图3）。

3讨论与结论

规模化养羊场疫病往往是在多种因素诱导下发生的，包括外界病原菌入侵或动物机体内细菌增殖紊乱等因素造成[11]。因此，对羊舍空气进行消毒是减少环境中的病原菌、消灭传染源、预防和控制羊群疾病的发生的重要措施。目前，消毒剂的种类繁多，消毒效果各异，在实际使用过程中存在选择不当造成效果不佳、疫病控制不力等问题。本试验对消毒剂杀菌能力进行比较分析，可筛选适用于规模化养羊场消毒使用的消毒剂。结果表明，通过测定消毒前后羊舍内空气细菌数量，4种消毒剂均有较好的消毒效果，其中溴氯海因杀菌效果最佳，杀菌率能达到76.5%，戊二醛癸甲溴铵次之，杀菌率为 58.6%，戊二醛杀菌率为42.8%，聚维酮碘消毒能力最弱，殺菌率为44.5%。卤素类消毒剂的杀菌效果具有广谱、高效、廉价等特点，是当前养殖生产中常用的消毒剂，其中氯的杀菌力最强，对皮肤和黏膜有刺激作用，广用于饮水消毒和厩舍、场地、车辆、排泄物等的消毒;碘杀菌能力稍弱，刺激性较小，一般用于皮肤消毒和创面消毒[12-13]。本研究使用的溴氯海因溶于水后可形成次溴酸和次氯酸，推测混合型消毒剂的消毒效果较好;多重组分的消毒剂戊二醛癸甲溴铵的杀菌效果也强于单一组份的消毒剂戊二醛。

空气中的致病菌可能通过微生物气溶胶的形式污染饮水槽或进入羊呼吸道引起感染，甚至污染羊场周围环境，威胁公共卫生安全[14]。本试验通过对优势菌落进行PCR鉴定发现，该羊场存在一定数量的致病菌，其中痢疾志贺氏菌可感染幼羊导致腹泻，从而引起大批发病和死亡;金黄色葡萄球菌常引发渗出性皮炎、乳房炎、拉稀、关节肿大和脓肿等，说明兽医人员应制定健全的卫生管理制度，做好环境消毒和免疫接种[15]。大肠杆菌是危害养羊生产的常见条件致病菌，在临床检测中分离率较高，耐药性也较强[16-17]。惠艳华等、陆桂平等和王磊等在上海、江苏和青海地区均检测到大肠杆菌病的发生[18-20]。颜艾等对贵州省发病羊进行细菌检测发现，大肠杆菌感染率较高，且检出大肠杆菌和支原体混合感染[21]。本试验羊场的空气中存在大肠杆菌，推测该细菌来源于羊群粪便和污水，因此羊场工作人员应加强粪便和污水的清理及无害化处理，防止大肠杆菌病的发生。本试验在羊舍空气中检测到枯草芽孢杆菌和屎肠球菌，近期研究表明这些细菌可作为日粮添加以提高动物的生长性能[22-23]，但其在羊舍空气环境中存在是否会对羊群健康造成影响，有待进一步探究。

以上结果表明，规模养羊场羊舍空气中细菌含量较高，种类繁多，且存在一些致病菌和条件致病菌。4种常见消毒剂杀菌效果均较好，其中以溴氯海因的消毒能力最佳，可在规模羊场推广应用。

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