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苯胺降解菌的分离及其降解特性

范文

王浩权朱兴华胡惠允孟祥敏崔岱宗

摘要：从吉林省吉林市某化工厂附近的土壤中分离到1株可在好氧条件下高效降解苯胺的菌株。经16S rDNA序列比对分析后发现，该菌株与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有较近的亲缘关系，基于此，将该菌株定名为Pseudomonas aeruginosa D5，该菌株可在温度为20～40 ℃、pH值为6～9及盐度为1%～3%的条件下对苯胺进行有效降解;菌株D5可对高浓度苯胺进行降解，可在52 h内降解90%以上1 000 mg/L的苯胺;此外，菌株D5可对反复添加的苯胺连续降解，以上的特性为其日后应用于苯胺废水的工业化处理创造了良好的条件。

关键词：苯胺;假单胞菌属;降解特性

中图分类号： X172

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）15-0287-04

苯胺（Aniline）是工业生产应用的一种重要化工原料，是农药、染料、塑料及药物生产中的重要原料及中间体，广泛存在于印染、制药、橡胶及其他诸多化工行业的生产废水中[1]。近年来，越来越多的苯胺废水被排放到自然水体和土壤中。苯胺毒性大且在自然环境中化学结构稳定，很难降解。苯胺具有严重的致癌、致畸、致突变的“三致”作用，并可以造成人或动物心血管系统、中枢神经系统以及其他脏器的损害，严重危害接触者的健康[2-3]。基于此，美国国家环境保护局（Environmental Protection Agency，简称EPA）已将苯胺列为优先控制的污染物，我国及其他各国也将其列为严重污染环境和危害人体健康的污染物[4]。

在自然环境下，苯胺主要是在各类微生物尤其是好氧细菌的作用下进行生物降解，其降解速率受微生物活性、环境条件（如溶氧量、温度、pH值）等因素的显著影响[5]。近年来，国内外学者已经对苯胺的微生物降解开展了大量的研究工作，越来越多的苯胺降解细菌得到分离和纯化，主要为不动杆菌属（Acinectobacter）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）、戴尔福特菌属（Delftia）细菌[6-8]。此外，许多学者对苯胺降解相关酶基因的克隆表达及序列分析、苯胺降解的代谢途径等进行了研究[9-12]。

虽然对苯胺生物降解的研究已取得了一定进展，但菌体对苯胺降解速度较慢、污染物耐受条件较差等缺点仍然极大地制约了降解菌株的工业化应用。因此，筛选苯胺降解能力更高、抗逆性更强的降解菌株仍然是目前研究工作的重点。

在本研究中，笔者从长期受苯胺废水污染的环境中分离出1株可在好氧条件下高效降解苯胺的细菌，并探讨不同理化因素对菌株降解苯胺的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究中用于筛选苯胺降解细菌的环境样品取自吉林省吉林市某染料生产厂附近的土壤。

富集培养基（LB液体培养基）：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g，加水至1 L，调pH值至7.0。

苯胺降解培养基：葡萄糖2 g、NH4Cl 1 g、Na2HPO4 2 g、NaH2PO4 1 g、MgSO4 0.2 g，加水至1 L，调pH值至7.0。进行降解试验时添加一定浓度的苯胺。

1.2 试验方法

1.2.1 苯胺降解菌株的筛选称取1 g环境样品，放入装有50 mL灭菌水的100 mL三角瓶中，将三角瓶置于摇床上在 100 r/min 下振荡1 h，将振荡后的悬浊液静置，上清液即为供接种的样品。

取1 mL样品加入装有50 mL LB液体培养基的100 mL三角瓶中，于37 ℃、120 r/min恒温振荡培养12 h。采用相同方法接种1代培养菌液1 mL至新鲜的LB液体培养基中进行富集培养，使样品中的好氧菌群得到活化。

向降解培养基中加入苯胺，使培养基中苯胺的终浓度达到200 mg/L，按2%（V/V）接种量接种第2次活化的混合菌液至苯胺降解培养基中进行培养。采用此方法对混合菌液进行连续筛选培养，观察苯胺的降解效果，初步确定混合菌液中是否存在能够高效降解苯胺的菌株。

将筛选后的混合菌群在固体苯胺降解培养基（苯胺浓度200 mg/L）上进行划线分离，并对长出的单菌落重新进行划线培养。

将筛选出的菌株转接种于LB液体培养基中，并向其中加入20%甘油作为保护剂，于-40 ℃冰箱中保藏。

1.2.2 苯胺濃度的测定对苯胺浓度的测定采用萘乙二胺偶氮光度法[13]。

1.2.3 降解菌株的鉴定采用16S rDNA序列分析方法对分离出的苯胺降解细菌进行鉴定。菌株基因组DNA采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法[14]进行提取。以提取的菌株DNA为模板，采用细菌通用引物27F：5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′、1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′对细菌的16S rDNA序列进行扩增。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸 2 min，30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。将经纯化后的PCR产物连接至pMD 18-T质粒上，并转化至大肠杆菌JM109感受态中，取50 μL转化菌液涂布于LB固体培养基上，在37 ℃下培养16 h，挑取阳性克隆子进行序列测定。测序结果经软件拼接及人工校对后，通过BLAST程序与GenBank 中的核酸数据库进行比对并下载相关序列，采用ClustalX 1.81软件进行多序列比对，Phylip 3.67软件对序列进行亲缘性及系统发育分析。

1.2.4 菌体生长曲线及苯胺降解曲线的测定将菌种按2%（V/V）接种量接种到含有200 mg/L苯胺的苯胺降解培养基中，于37 ℃、120 r/min培养箱内培养，每3 h取样1次测菌体在600 nm处的吸光值（以液体筛选培养基为空白对照）。

取2 mL菌液在8 000 r/min下离心10 min后测定上清液中的苯胺残余含量，并计算苯胺的降解率。

1.3 不同理化因素对菌株降解苯胺的影响

1.3.1 温度对菌体生长及苯胺降解的影响将经活化后的菌株按2%（V/V）接种量接种至无机盐降解培养基（含有 200 mg/L 苯胺）中，分别置于15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的环境下培养16 h后，取3 mL菌液测定菌株生长量（D600 nm）及苯胺的降解率。

1.3.2 pH值對菌体生长及苯胺降解的影响将经活化后的菌株按2%（V/V）接种量接种至无机盐降解培养基（含有 200 mg/L 苯胺）中，培养基的pH值分别为4、5、6、7、8、9、10，于35 ℃好氧条件下培养12 h后，取3 mL菌液测定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.3.3 盐度对菌体生长及苯胺降解的影响向降解培养基中添加NaCl，使其终浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%，将经活化后的菌株按2%（V/V）接种量接种至无机盐降解培养基（含有200 mg/L苯胺）中，于35 ℃好氧条件下培养12 h后，取3 mL菌液测定菌株的D600 nm及苯胺的降解率。

1.4 苯胺浓度对降解率的影响

在无机盐降解培养基中分别加入不同浓度的苯胺（400、600、800、1 000 mg/L），将经活化后的菌株按2%（V/V）接种量接种至上述含有不同浓度苯胺的培养基中，于35 ℃好氧条件下培养，记录不同浓度苯胺的降解时间及降解率。

1.5 连续投加苯胺对降解率的影响

将经活化后的菌株按2%（V/V）接种量接种至含有 200 mg/L 苯胺的培养基中，于35 ℃好氧条件下培养，待培养基中的苯胺降解完全后，再向培养基中投加苯胺，使培养基中苯胺浓度重新达到200 mg/L，当第2次投加的苯胺降解后，继续向培养基中投加苯胺。重复以上步骤，测定每次投加苯胺的降解率及降解时间。

2 结果与分析

2.1 苯胺高效降解菌株的分离与鉴定

环境样品经过富集后，在含有苯胺的降解培养基中进行筛选，经反复平板划线纯化，得到1株苯胺降解细菌，命名为D5。对菌株D5的16S rDNA序列进行扩增测序后，结合美国国立生物技术信息中心（NCBI）数据库中的序列信息对该菌株进行分子生物学鉴定。测序结果表明，PCR产物的长度为1 500 bp。将序列进行Blast比对后，下载相关序列，进行系统发育分析，基于各菌株的16S rDNA序列利用最大简约法构建系统发育树，选取枯草芽孢杆菌为外群，大于50%的自展值标记于各分枝上，结果如图1所示。本研究筛选出的苯胺降解菌株与假单胞菌属中的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）聚为一枝，且与黄单胞菌属（Xanthomonas）菌株亲缘关系较近。基于此，笔者认为本研究所分离到的降解菌株属于铜绿假单胞菌，将该菌株定名为Pseudomonas aeruginosa D5。

2.2 菌株的生长曲线及苯胺的降解曲线

将菌株D5以2%（V/V）接种量接入含有200 mg/L苯胺的无机盐降解培养基中，测定菌体浓度和菌液中苯胺的残留量，从而检测菌株D5在培养基中的生长情况和对苯胺的降解情况。试验结果（图2）表明，菌株D5可在降解培养基中快速生长。在前3 h对培养环境适应后，菌株D5在培养基中呈现对数生长趋势，16 h后菌体的D600 nm值可达到约1.65，由此可见200 mg/L苯胺对菌株D5的生长没有明显的抑制作用。在菌株生长的同时，培养体系中的苯胺浓度迅速下降，15 h内苯胺的降解率即达到90%以上，至18 h培养基中的苯胺已被完全降解。表明菌株D5是1株可在好氧条件下对苯胺进行有效降解的菌株。

2.3 温度对菌体生长及苯胺降解的影响

本研究采用菌液浊度（D600 nm）来间接反映菌株的生长速率。从图3可以看出，菌株D5在35 ℃下的生长速率及对苯胺的降解速率均达到最大值。在此温度下，菌株对200 mg/L

苯胺的16 h降解率达到99%。当温度在20～40 ℃之间时，菌株D5均保持着对苯胺较高的降解能力。如在40 ℃下，菌株经16 h的培养后仍可降解约70%的苯胺;然而，当温度为50 ℃时，菌株的生长速率急剧下降，苯胺的降解率也明显降低。

温度过高或过低均会降低菌株的生长速率并抑制细菌内相关酶的活性，从而造成苯胺降解速率的下降。值得注意地是，菌株D5在低温下具有一定的苯胺降解能力，当温度仅为15 ℃时，菌株D5仍可在16 h内降解约32%的苯胺。东北三省冬季较寒冷，污水管道内的水温只有10～15 ℃，低温严重影响了活性污泥或降解菌株对污染物的降解速率。因此，筛选出在低温条件下仍可降解苯胺的菌株具有较为重要的现实意义。

2.4 pH值对菌体生长及苯胺降解的影响

从图4可以看出，菌株对苯胺降解的最适pH值为7.0，在该pH值条件下，菌株可以在16 h内降解约99%的苯胺。当降解培养基的pH值维持在6～9范围内时，pH值的变化并未对细菌的生长和苯胺的降解造成明显影响，在该pH值范围内，经过16 h的培养，菌株D5可对苯胺维持85%以上的降解率。菌株D5有一定的耐碱性，在降解体系pH值为10时，菌株仍可在16 h内降解约70%的苯胺。

与温度变化对细菌降解能力的影响相似，pH值过高或过低均会对苯胺的降解产生负面影响，其原因是过碱和过酸条件可能会影响菌体的生长和与苯胺降解有关酶的活性。

2.5 盐度对菌体生长及苯胺降解的影响

从图5可以看出，当降解体系中的盐度逐渐增大时，菌株D5的生长速率逐渐减小;与之相对应，苯胺的降解速率也逐渐减小。然而，菌株D5仍具备一定的耐盐性，当降解体系中

的盐浓度为1%～3%时，菌株在16 h内可对苯胺维持80%以上的降解率，即使当降解体系内的盐度达到5%时，菌株仍可在16 h内降解约32%的苯胺。

2.6 苯胺浓度对降解率的影响

从表1可以看出，菌株D5可有效降解不同浓度的苯胺。当苯胺的浓度为400、600、800、1 000 mg/L时，菌株D5可分别在24、30、40、52 h内达到90%以上的苯胺降解率。表明菌株D5可在较高浓度的苯胺环境中生长并高效降解苯胺，说明菌株D5对高浓度的苯胺废水具有极大的降解潛力。

2.7 连续投加苯胺对降解率的影响

从图6可以看出，菌株D5可在16 h内对降解体系中第1次添加的苯胺基本完全降解（降解率大于98%）。在第2与第3次添加苯胺后，菌株D5均可在16 h内降解90%以上的苯胺。在第4次添加苯胺后，菌株对苯胺的降解速率稍有变慢，培养16 h后约有80%的苯胺被降解。表明菌株D5有能力对连续添加的苯胺进行降解。

苯胺降解变缓可能是由于降解体系中营养成分逐渐耗尽，剩余营养成分已经不能满足菌体的生长和代谢。另外，降解体系中的pH值、溶氧量等理化因素也越来越不适合菌体的生长。

3 结论与讨论

本研究在化工厂附近的土壤中分离到1株可以在好氧条件下对苯胺进行降解的菌株D5。经分子生物学鉴定后发现，该菌株与铜绿假单胞菌有较近的亲缘关系。之前已经有报道证明，假单胞菌属细菌可在好氧条件下高效地降解苯胺类化合物，如Oliver等从活性污泥中分离到的假单胞菌属细菌可以降解浓度为100 mg/L以下的二苯胺[15];Bengtson等在工业废水中筛选出的假单胞菌属细菌可有效降解低浓度的氯代苯胺，然而，当降解底物浓度过大时，菌株的生长受到明显抑制[16]。假单胞菌属经菌细胞内含有苯胺双加氧酶（aniline dioxygenase），可将苯胺氧化为邻苯二酚，邻苯二酚通过邻苯二酚2，3-双加氧酶（catechol-2，3-dioxygenase）继续氧化，最后生成丙酮酸和乙醛，进入三羧酸循环，彻底得到矿化。假单胞菌属细菌是环境中常见的革兰氏阴性细菌，是很多污染物的分解菌株且大部分种属对人类危害较小，因此，有较高的潜力应用于苯胺废水的工业化处理中。

本研究筛选出的菌株可在好氧条件下高效降解苯胺。理化因素对菌株的影响显示，该菌株可在温度为20～40 ℃、pH值为6～9及盐度为1%～3%的条件下对苯胺进行有效降解。低浓度的盐离子是微生物生长所必需的，盐离子可调节细胞渗透压，维持膜平衡，且对部分酶促反应有促进作用。然而，当盐离子浓度过高时，会对微生物的正常生长产生危害。因此，大多数细菌生活在盐浓度小于1%的环境中。然而，工业苯胺废水中往往含有较高浓度的盐离子。因此，筛选能在较高盐浓度下高效处理苯胺废水的菌株具有重要意义。在本研究中，菌株D5可以在高盐度条件下对苯胺进行降解，这为该菌株今后应用于高盐度苯胺废水的工业化处理提供了条件。该菌株对较高浓度的苯胺具有良好的降解效率，并可以进行苯胺的连续降解。以上的特性为其日后应用于苯胺废水的工业化处理创造了良好的条件。

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