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耐盐促生菌的筛选、鉴定及其对黄瓜的促生作用

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钱兰华钱玮沈雪林胡翠英刘乾蒋晨威朱昫飏王桃云

摘要：为获得耐盐促生菌株并明确其促生特性，通过耐盐试验和ACC脱氨酶活性对沿海滩涂盐碱地土壤中的微生物进行分离筛选，得到5株耐盐菌株，其中B7的耐盐活性最强。接着采用平皿法和盆栽法研究了盐胁迫下黄瓜种子发芽及盆栽试验中B7对黄瓜的耐盐促生作用。同时对B7的多种促生能力进行测定，最后通过菌株形态、生理生化特征测定及其16S rDNA序列鉴定出B7菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。研究结果表明，该菌株能明显提高黄瓜耐盐促生能力，同时具有产吲哚乙酸（IAA）、产氨、固氮及解磷等多种促生能力，因而具有广泛的应用前景。

关键词：耐盐;分离筛选;鉴定;巨大芽孢杆菌;黄瓜;促生作用

中图分类号： S154. 39文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）18-0160-04

收稿日期：2018-05-31

基金项目：江苏省苏州市科技计划项目-应用基础研究计划（编号：SYN201525）。

作者简介：钱兰华（1976—），女，江苏兴化人，副教授，主要從事植物病虫害综合防治研究。E-mail：lanhuaqian@126.com。

通信作者：王桃云，博士，副教授，主要从事植物、微生物资源研究。E-mail：wangtaoyun@usts.edu.cn。

土壤盐渍化是一个全球性的农业问题，是当前威胁全球农业生产和农作物产量的主要非生物胁迫因子，目前全球有50%的灌溉土地受到不同程度的盐害[1]。中国盐渍土壤的分布范围广、类型多，总面积约1亿hm2，而且盐碱地面积正逐年增加[2]。如何改良和利用大面积盐渍化土地，以及保护并提高重要的经济作物抵抗盐胁迫的能力是当前国际社会亟待解决的重要农业科技问题。目前，主要生物改良方法是培育并种植耐盐碱作物，如种植柽柳、水稻、向日葵以及耐盐植物田菁、紫穗槐等，此外还有耐盐转基因植物的研究，但该类方法往往周期长、花费大，同时，植物转基因方法还未被社会广泛接受和认可[3]。

根际微生物是指在植物根系土壤范围内生长繁殖细菌、放线菌、真菌等微生物。大多数根际微生物对植物无害且对植物生长有促进作用。这些根际微生物具有固氮、溶磷、产生植物生长激素、铁载体以及诱导植物抗性的功能。利用根际微生物提高盐碱地作物耐盐促生能力的方法具有投资少、见效快、效益高等特点。因此有关根际微生物耐盐促生的功能活性研究已经受到相关研究者的广泛关注[4]。

本研究拟对沿海滩涂植物根系周围土壤中耐盐微生物进行筛选，并对筛选出的优势耐盐菌株耐盐特性、多种促生能力及其对盐胁迫下黄瓜种子发芽及盆栽试验中的耐盐促生作用进行研究。最后通过菌株形态、生理生化特征测定及其16S rDNA序列初步鉴定出耐盐优势菌株的种属，以期为提高农作物抗盐能力提供新策略。

1?材料与方法

1.1?样品采集

土样采自江苏省南通市启东吕四镇的海边滩涂，土壤采样深度为5～20 cm，采回的土壤经风干、粉碎后过100目筛待用。

1.2?主要仪器

超净工作台（SW-CJ-1FD），上海新苗医疗器械公司;高速冷冻离心机（Fresco 17），美国Thermo公司;高压蒸汽灭菌锅（LDZX-50FB），上海博迅实业有限公司;数显pH计（PHS-3TC），上海天达仪器有限公司;紫外可见分光光度仪（UV-2450），日本岛津公司;恒温摇床（TS-2102），上海天呈实验仪器制造有限公司;光学显微镜（CX21），日本奥林巴斯公司。

1.3?主要试剂与培养基

2-羟基丁二酸，2-甲基-3-羟基-4，5-二羟甲基吡啶盐酸盐，哌嗪-1，4-二乙磺酸，吲哚-3-乙酸，三氧化钼，乙二胺四乙酸铁钠等购于上海阿拉丁生化科技有限公司;胰蛋白胨，酵母粉，琼脂粉，氯化钠，α-氨基吲哚基丙酸，维生素H，考马斯亮蓝，奈斯勒试剂和钼酸钠等购于上海国药集团化学试剂有限公司。

LB培养基，无机磷和有机磷培养基，CAS检测平板，AF培养基，DF培养基和ADF培养基，无色氨酸King培养基，WA培养基，NA培养基等[5-7]。

1.4?耐盐菌株的分离筛选

1.4.1?土壤菌株分离纯化?取处理好的土样1 g悬浮于装有100 mL无菌水的250 mL三角锥形瓶中，在30 ℃、180 r/min 摇床中振荡30 min，静置10 min，得到土壤悬浮液。然后将此悬浮液稀释为原始浓度的10-1～10-5倍，涂布于LB培养基平板上，于30 ℃在恒温培养箱中培养24 h后，挑取各种不同类型的单菌落，经过多次平板纯化后，接种于LB斜面并在4 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2?菌株耐盐能力测定[8]?利用含一定NaCl浓度的NA培养基筛选耐盐菌株。用移液器分别取土壤稀释液0.1 mL涂布于盐浓度为6%的培养基平板上，30 ℃培养3 d，以相同条件下各平板中菌落数量多少来筛选耐盐优势菌株。

1.4.3?耐盐菌株ACC脱氨酶活性测定

通过制作α-丁酮酸标准曲线来测定α-丁酮酸含量：按照赵龙飞等所述方法[9]，测定菌株粗酶液在540 nm波长下的吸光度，并以α-丁酮酸标准品的浓度（mmol/L）为横坐标，以吸光度（D540 nm）为纵坐标，绘制α-丁酮酸标准曲线，计算粗酶液中的α-丁酮酸含量。

ACC脱氨酶比活力测定：参照Bradford的方法[10]比色测定细胞提取液中总蛋白质含量，以牛血清白蛋白作为标准物，绘制牛血清白蛋白标准曲线。参考Saleh等的方法[11]，以反应体系中每毫克菌体蛋白酶每小时催化ACC脱氨生成α-丁酮酸的微摩尔量表示ACC脱氨酶活性，其单位为μmol/（mg·h），设置空白对照。测定结果为3次重复值。

1.5?优势耐盐菌株B7的各种促生能力测试

1.5.1?B7固氮能力的测定[12]

活化细菌，挑取单菌落于LB培养液中培养18 h，分别吸取10 μL菌液到固氮培养基（NFb）平板上，菌株能在NFb中生长，且能使培养基变蓝者视为有固氮活性，记录为“+”，不变色记录为“-”。

1.5.2?B7菌株解磷能力测定

参照Ribeiro等所述方法[13-14]，活化B7菌株，挑取单菌落于2 mL LB培养液中培养18 h，分别吸取10 μL菌液到有机磷培养基（OPA）和无机磷培养基（NPA）平板上，28～30 ℃培养96 h。观察方法：NPA平板上有无透明圈，有透明圈者记录为“+”，无透明圈者记录为“-”;OPA平板上有浑浊斑记为“+”，无浑浊斑则记录为“-”;

1.5.3?B7菌株产嗜铁素活性的检测

通过CAS检测平板法进行细菌产嗜铁素活性检测[15]。根据检测平板中是否产生橘黄色晕圈来判断菌株是否能产生嗜铁素。观察方法：CAS平板上有橘黄色晕圈者记录为“+”，无橘黄色晕圈者记录为“-”。

1.5.4?B7菌株產IAA能力测定

参照Wichner等的方法[16-17]，将分离纯化后的菌株接种于具有L-色氨酸的LB液体培养基中，摇床培养24 h。取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入等量Salkowski显色液进行显色反应，同时以加入等量IAA标准液作为阳性对照，在室温、避光条件下放置显色0.5 h，颜色变红者表示能够产生IAA。

1.5.5?B7菌株产氨能力测定

产氨能力的测定参照康贻军等的方法[5]。将菌株转接到含10 mL蛋白胨水（10 g/L）试管中，28 ℃培养48 h，每管加入0.5 mL Nesslers试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有氨产生。试管中溶液由褐色转为黄色者记录为“+”，试管中溶液不变色者记录为“-”。

1.5.6?菌株赋值评估

根据以上促生能力测试结果，对耐盐优势菌B7的促生潜力进行赋值评估，具有某种促生能力时赋1分，没有该促生能力时赋0分。

1.5.7?B7菌株酸产碱能力测定

取B7菌悬液200 μL加到NFM培养基（50 mL）中，在摇床上以180 r/min、30 ℃条件下培养3 d。观察颜色，若培养液变成黄色则说明此菌株是产酸菌株;若变成蓝色则说明此菌株是产碱菌株。

1.6?耐盐生长曲线的测定

配制不同氯化钠浓度（2%、4%、6%、8%、10%）的LB液体培养基，将B7接种至不同盐浓度的培养基中，在摇床上以180 r/min、30 ℃条件下培养24 h后取出，在600 nm波长下测定其吸光度，以盐浓度为横坐标，D值为纵坐标，制作耐盐生长曲线。

1.7?菌株理化性质检测

参照《常见细菌系统鉴定手册》[18]和《伯杰细菌鉴定手册》（第8版）[19]进行耐盐优势菌株B7的形态和生理生化鉴定。

1.8?菌株B7分子学鉴定

将菌株用LB液体培养液培养至对数生长期，离心收集菌体，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，提取总基因组DNA，采用通用引物27F/1492R（正向引物5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行16S rDNA基因扩增。产物测序后，将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，构建系统发育树以确定菌株的分类。

1.9?菌株B7对黄瓜发芽的促生试验

取黄瓜种子适量放入烧杯中进行消毒灭菌，然后用无菌水清洗3次;把上述已清洗好的黄瓜种子放入耐盐菌株B7菌液中浸泡6 h，备用。准备适量的培养皿，将脱脂棉平铺在培养皿底层，盖好后灭菌待用;配置不同盐浓度的氯化钠溶液，灭菌后倒入培养皿中并没过脱脂棉，做好标记;将已经浸泡过菌液的黄瓜种子放入不同盐浓度的培养皿中，每个培养皿中放40个种子（以加蒸馏水的培养皿作为空白对照），放入光照培养箱中25 ℃培养7 d（前3 d暗培养，后4 d12 h光照培养，12 h暗培养）;试验结束后记录黄瓜种子发芽率、鲜质量和干质量（每组3个重复）。

1.10?菌株B7对盆栽黄瓜的促生试验

取黄瓜种子适量放入烧杯中进行消毒灭菌，然后用无菌水清洗3次;把上述已清洗好的黄瓜种子放入耐盐菌株B7菌液中浸泡6 h，备用。采用营养土与蛭石（体积比4 ∶1）混合得到盆栽基质，然后在121 ℃灭菌1 h，冷却后装至穴盆中（长10 cm×宽10 cm×高10 cm），每盆装入200 g。分别设置空白对照组（无盐胁迫）、盐胁迫组和盐胁迫加菌组，每组做5个重复。每盆种入处理好的黄瓜种子3粒（盐加菌组的种子先用菌株B7菌液浸泡6 h，空白组和盐胁迫组用灭菌水浸泡6 h），接着用不同溶液浇灌（空白组用无菌水浇灌，盐加菌组用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液浇灌，盐胁迫组用200 mmol/L NaCl溶液浇灌），每周浇灌处理1次，其余时间都浇灌无菌水，出苗后，算出发芽率和出苗率，然后每盆保留1株幼苗，1个月后测定总根长、总投影面积、总根表面积、平均根系直径和根尖数等生长指标及可溶性糖、赖氨酸含量等生理指标。

1.11?数据分析

采用Excel 2010作图，SPASS 19.0进行数据分析。

2?结果与分析

2.1?耐盐细菌的分离筛选

采用平板稀释法共分离出27株菌株，经过耐盐试验的定性筛选，共有5株耐盐菌株。耐盐菌株命名分别为B1、B3、B5、B6和B7，其余22个菌株都没有在6%盐浓度的平板上长出来。5个菌株耐盐试验结果（表1）显示，B7菌株的耐盐活性最强。同时，菌株ACC脱氨酶活性试验结果（表2）显示，菌株B7的ACC脱氨酶活性最强，达到0.852 U/（mg·h）。由耐盐试验和各菌株ACC脱氨酶活性试验结果可知，B7菌株的耐盐能力和ACC脱氨酶活性都优于其他几个耐盐菌株，因此选择B7菌株进行进一步研究。

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