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牛蒡皮固体发酵杏鲍菇的动力学模型

范文

姚凤腾董玉玮

摘要：微生物反应的动力学模型的建立，能够在发酵过程中放大试验数据，提供最佳的控制和模拟，也为分批发酵、补料分批发酵、连续发酵的过渡提供了理论基础。本试验选择杏鲍菇菌株，使用牛蒡皮作为基质，采用固体发酵方法培养杏鲍菇菌株，以检测菌丝多糖和三萜类化合物的含量。建立了牛蒡皮固体发酵杏鲍菇在不同温度、时间和限制基质条件下的动力学模型，并对模型参数进行了非线形回归分析。不同培养时间下，用Logistic模型拟合杏鲍菇生长状况，多糖最高增长量为0.612 6 mg/（g·d），三萜最高增长量为0.645 1 mg/（g·d）。在基质限定条件下，Logistic模型和统一动力学方程均能较好拟合。在不同温度下，Lorentz模型得出多糖增长量最高时，最适生长温度为28.43 ℃，三萜增长量最高时，最适生长温度为28.72 ℃。所建数学模型能较好地描述实际的固体培养过程，为快速有效地采用牛蒡皮固体培养杏鲍菇提供了理论依据和技术支撑。

关键词：牛蒡皮;杏鲍菇;动力学模型;固体发酵;多糖;三萜

中图分类号： TS201.1 ?文献标志码： A ?文章编号：1002-1302（2020）24-0144-04

牛蒡是一種具有较高营养价值的根茎植物，含有丰富的营养成分，包括纤维素、胡萝卜素、蛋白质、金属离子以及多种氨基酸和维生素。牛蒡可供药食，在所有地下根茎类的蔬菜中，膳食纤维含量是最高的[1]。牛蒡根药性味苦、性寒、可清热、祛风，可以帮助加快新陈代谢、清除肠胃中残留的垃圾、促进血液的流通、降低胆固醇、降低血糖浓度、防止高血脂和高血压[2-3]。杏鲍菇（Pleurotus eryngii），因具有杏仁香味和鲍鱼口感而得名，隶属担子菌门、伞菌目、侧耳科、侧耳属[4]。杏鲍菇富含蛋白质、人体必需的各种氨基酸[5]和极其丰富的生物活性物质，如多糖、脂类、多肽、三萜等[6]，具有降血糖、降血脂、增强人体免疫力、美容养颜等功效[7]。

由于牛蒡皮中难以再利用的纤维素含量较高，牛蒡皮通常被当作废弃物丢掉，而微生物尤其是一些药用真菌如杏鲍菇等，具有分解、利用纤维素的能力。为了充分利用这类废弃物，本研究以牛蒡皮为固体培养基，精心选取优良杏鲍菇菌株，采用固体发酵技术，结合经典微生物动力学模型理论，确立多糖和三萜类产量增长的发酵动力学参数，并建立相应的数学模型，为以后快速有效地培养杏鲍菇提供了理论依据和技术支撑。已有10多种方程可用来描述生物化学动力学方面的底物变化或生物增长过程的变化，例如，Logistic模型是一个非线性方程，通常用于表达细胞的生长和营养物之间的关系，并且曲线通常是S形。对于细菌的生长、细菌浓度的增加和它自己增长的关系，可用Logistic模型进行拟合，培养时间不同时，Logistic模型也具有一定的适用性[8]。然而，每个方程有自己的缺点，不能被广泛应用到各种领域。如何统一这些方程是一个亟待解决的问题。张艳秋基于酶动力学原理，通过数学推导，提出了一个新的基本生化反应动力学方程[9]，几乎涵盖了所有现有的动力学方程。这个方程结合现有的动力学方程，被称为统一动力学方程。目前，对使用相关模型，研究食用菌的发酵过程还没有相关报道。

这项研究将有助于进一步了解发酵过程中菌丝生长和产品形成，以及影响这些产物的环境因素，并为有效控制菌种的整个发酵过程提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杏鲍菇菌种：为笔者实验室保存的高产多糖菌株;原料：牛蒡由徐州天马敬安食品有限公司提供;试剂：提取与检测试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HH.B12.601-S-Ⅱ恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂;FA21240电子天平，精密科学仪器（上海）有限公司;150B生化培养箱，国华电器（常州）有限公司;W14646分光光度计，上海欣茂仪器有限公司;HH-4恒温水浴锅，国华电器（常州）有限公司;SW-CJ-1F洁净工作台，苏净安泰空气技术有限公司;IXQ-SG45-280A蒸汽灭菌锅，上海讯博实业有限公司医疗设备厂;FSD-101A电动粉碎机，新恩精密粮仪（台州）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配制 PDA 培养基：去皮甘薯 200 g/L，琼脂 20 g/L，葡萄糖 20 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，酵母膏 3 g/L，KH2PO4 3 g/L，少量维生素B1。

1.3.2 杏鲍菇菌种的活化先配制PDA 培养基，然后活化杏鲍菇菌种，28 ℃下培养 7 d。

1.3.3 固体发酵培养杏鲍菇

1.3.3.1 培养温度粉碎牛蒡皮至5 mm长度，以20 g/250 mL为装瓶量，将牛蒡皮装入瓶中，高压灭菌20 min。将已活化的杏鲍菇菌种转接于牛蒡皮固体培养基中，分别在22、25、28、31 ℃下培养15～20 d，至菌丝体铺满培养基，菌丝体于60 ℃烘箱中烘干备用。

1.3.3.2 培养时间粉碎牛蒡皮至5 mm长度，以20 g/250 mL为装瓶量，将牛蒡皮装入瓶中，高压灭菌20 min。将已活化的杏鲍菇菌种转接于牛蒡皮固体培养基中，放入28 ℃恒温培养箱中培养，在第3、5、7、9、10、11、13、15、17、19、21天，对菌丝体进行多糖和三萜的提取和测定。

1.3.3.3 培养基质粉碎牛蒡皮至5 mm长度，以20 g/250 mL为装瓶量，将牛蒡皮装入瓶中，高压灭菌20 min。将已活化的杏鲍菇菌种转接于牛蒡皮固体培养基中，放入28 ℃恒温培养箱中培养，从第3天起，每隔6 h或12 h取出，对菌丝体进行多糖和三萜的提取和测定。

1.3.4 杏鲍菇多糖的提取与测定[10-11]

1.3.4.1 标准曲线绘制精确称取无水葡萄糖0.500 0 g，至100 mL容量瓶稀释定容，取溶液1 mL于50 mL容量瓶，定容。 2.50 mL容量瓶中分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，至试管，每样平行3次，分别加入2 mL的蒸馏水、1 mL的6%苯酚和 5 mL 的浓硫酸，混匀，放在沸水浴中加热15 min，然后冷却。分光光度计测量490 nm处的吸光度。标准曲线方程为y=0.014 5x+0.014 7，r2=0.992 9。

1.3.4.2 提取方式首先用热水溶解。粉碎子实体，按照 1 g 子实体10 mL 纯水的比例，在 40 ℃水浴锅溶解过夜，离心取其上清液，离心条件设置为 4 000 r/min，离心时间 5 min。加入上清液5 倍体积的95%乙醇，静置过夜，取出后4 000 r/min，离心 5 min，弃上清，沉淀为粗多糖。

1.3.4.3 测定方法粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。先将多糖样品加水定容 100 mL，取 2 mL 待测样品放在试管中，加 1 mL 浓度为 6% 苯酚，5 mL 浓硫酸，充分摇匀，静置 5 min，放入 100 ℃水浴锅中水浴15min，冷水冷却，490 nm下测定吸光度，按上述葡萄糖标准曲线方程计算粗多糖含量。

1.3.5 三萜的提取与检测[12]

1.3.5.1 绘制标准曲线取干净试管7支，分别取20、40、60、80、100、120、140 μg的齐墩果酸，放入试管内。向7支试管中加入现配制的0.3 mL香草醛和1.0 mL高氯酸，振荡混匀，60 ℃水浴20 min，冷却 15 min，再加入5 mL冰醋酸，于波长550 nm处测定吸光度。標准曲线方程为y=0.004 9x-0.009 2，r2=0.998 3。

1.3.5.2 提取方式取烘干后菌丝体粉碎，取1 g于烧杯中，加50 mL甲醇，静置，溶解过夜。过滤溶解液，60 ℃水浴加热，直至蒸干液体，再倒入40 mL无水乙醇至烧杯中，使其溶解。

1.3.5.3 测定方法三萜检测采用香草醛-高氯酸比色法。取溶解液1 mL至试管中，依次加入 2 mL 5%香草醛、5 mL高氯酸，混合均匀之后，在 60 ℃ 水浴20 min，冷却15 min，加入冰醋酸5 mL，于波长550 nm处测定其吸光度。

1.4 数据分析

采用Origin 9.0 软件处理数据、方程拟合并作图，所有数据用x±s表示。

2 结果与分析

2.1 多糖和三萜类增长量随温度变化的模型

杏鲍菇多糖和三萜增长量会随温度变化，采用Origin 9.0软件中的Lorentzian 模型，对测定的多糖和三萜数据分别进行拟合，结果见图1、图2。

由图1、图2可知，在28 ℃时，杏鲍菇多糖和三萜增长率最高，小于或大于28 ℃时，杏鲍菇多糖、三萜增长率会下降，说明在28 ℃是杏鲍菇生长最旺盛。由图1可知，杏鲍菇的最适生长温度为28.43 ℃（r2=0.997 4），实际培养最佳温度为 28 ℃，实际值与预测值接近。参数估计为：y0=-3.340 7，x0=28.428 8，w=51.003 7，A=297.025 2。经统计学检验，P=0.009 29<0.05，说明用自变量预测因变量结果可信;F=6 256.9远大于1，说明各组数据间的差异极显著，有统计学意义。因此不同温度下多糖产量增长的动力学过程可以用该方程描述。

由图2可知，杏鲍菇的最适生长温度为 28.72 ℃（r2=0.990 2），实际培养最佳温度为 28 ℃，实际值与预测值非常接近。参数估计为：y0=0.609 2，x0=28.716 4，w=6.348 5，A=3.342 6。经统计学检验，P=0.003 15<0.05，说明用自变量预测因变量结果可信;F=54 578.2远大于1，说明各组数据间的差异极显著，有统计学意义。因此可以用该方程描述不同温度下多糖含量的动力学过程。推测当温度≤25 ℃时，酶活性较低，多糖与三萜的合成途径受到抑制;温度≥31 ℃，酶失活，多糖与三萜合成途径受到抑制;28 ℃左右，酶活性较高，多糖与三萜产量增高。

2.2 多糖和三萜类增长量随时间变化的模型

杏鲍菇多糖和三萜增长量会随时间变化，采用Origin 9.0软件中的Logistic模型，对测定的多糖和三萜数据分别进行拟合，结果见图3、图4。

从图3、图4可以看出，在发酵前6 d，菌丝体处于生长适应期，长势较慢;第6～15天，菌丝体处于对数生长期，呈几何数增长;发酵第15～21天，菌丝体处于稳定期，生长速率下降，并逐渐趋于平缓。从图3可看出，Logistic模型相关系数r2为 0.996 5，达极显著水平，概率值P<0.01，说明拟合方程与试验数据很吻合，F=2 2937.7，远大于1，说明各组数据间存在极显著差异，有统计学意义，可以使用此模型模拟牛蒡皮固体发酵杏鲍菇生成多糖的生长动态。

从图4可看出，Logistic模型拟合出的曲线相关系数r2为0.999 6，达极显著水平，概率值P<0.01，说明拟合方程与试验数据很吻合，F=707 008.1，远大于1，说明各组数据间存在极显著差异，有统计学意义，可以使用此模型模拟牛蒡皮固体发酵杏鲍菇合成三萜的生长动态。

2.3 限定基质对多糖和三萜类增长量的影响

限定基质下测得杏鲍菇多糖和三萜增长量，采用Origin 9.0软件中的Logistic模型，对测定的多糖和三萜数据分别进行拟合，结果见图5、图6。

从图5可以看出，采用Logistic模型拟合的相关系数r2为0.995，达显著水平，F值远大于1，说明各组数据之间存在显著差异，具有统计学意义。采用统一动力学模型拟合的曲线的相关系数r2为0.980，达到显著水平，F远大于1，说明拟合的方程与试验的数据点也较吻合，也可以使用统一动力学方程模拟杏鲍菇的生长动态。

从图6可以看出，用Logistic模型拟合出的相关系数r2为0.994，达显著水平，F大于1，说明各组数据间存在显著差异，具有统计学意义。其中，用统一动力学方程拟合的曲线的相关系数r2为0.949，达显著水平，F大于1，说明拟合方程与试验数据点较吻合，可以使用统一动力学方程模拟牛蒡皮固体发酵杏鲍菇产生三萜的增长量。由图5、图6拟合模型结果发现，经比较，Logistic模型拟合的效果较统一动力学模型要好，因此可以用Logistic模型拟合在有限的基质条件下牛蒡皮固体发酵杏鲍菇生长所产生的多糖和三萜增长量。

3 结论

根据不同温度下多糖和三萜类含量增长率的测定结果，采用Lorentz方程拟合，最适生长温度分别为28.43 ℃和28.72 ℃。根据多糖和三萜类含量增长率随培养时间变化的测定结果，采用Logistic模型拟合，菌丝体生长第6～15 d，多糖和三萜类含量增长速度最快。根据限定基质条件下菌丝体多糖、三萜类的增长率，采用Logistic模型和统一动力学模型同时拟合，由拟合结果可知，相比动力学模型，Logistic模型拟合效果更好，具有更高的准确性，对菌丝体生长和反应状况具有指导意义。

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