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一株菌的聚酮合成酶基因验证及其鉴定

范文

唐培培贾真郭传滨杨立均孙会忠许晓敬

摘要?采用土壤微生物稀释平板法分离技术，从烟草根际土壤分离到一株活體纯培养物，将其编号为ZMD1。ZMD1菌株与2种病原的拮抗试验均显示出一定的抗菌活性;通过聚酮合成酶（PKS）基因的兼并引物对ZMD1进行了克隆验证，测序结果与其他物种的PKS基因序列具有较高的相似性，故将ZMD1初步定性为产聚酮合成酶活性菌株。综合ZMD1菌株的一般形态特征、生理生化特征和菌株的16S?rDNA保守序列特征分析，初步将ZMD1确定为链霉菌属（Streptomyces）菌株，暂命名为Streptomyces?sp.ZMD1。ZMD1可作为烟草病害生防菌剂、土壤保育菌剂和专用菌肥等开发的良好备用材料。

关键词?烟草;根际土壤;生防菌;分类鉴定

中图分类号?S572文献标识码?A文章编号?0517-6611（2020）07-0160-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.045

Polyketone?Synthase?Gene?Validation?of?a?Strain?and?Its?Identification

TANG?Peipei，JIA?Zhen，GUO?Chuanbin?et?al

（Zhumadian?Branch?of?Henan?Provincial?Tobacco?Company，Zhumadian，Henan?463000）

Abstract?A?pure?bacterial?culture?was?isolated?from?tobacco?rhizosphere?soil?by?plate?culture?technique，and?its?number?was?ZMD1.?ZMD1?strain?showed?some?antagonistic?activity?against?two?pathogens.?ZMD1?was?identified?as?a?polyketide?synthase?producing?strain?by?cloning?with?the?merger?primers?of?the?polyketone?synthase?（PKS）?gene，and?the?results?of?sequencing?were?similar?to?those?of?PKS?gene?sequences?of?other?species.?Based?on?the?general?morphological?characteristics，physiological?and?biochemical?characteristics?and?16S?rDNA?conservative?sequence?analysis?of?ZMD1?strain，ZMD1?strain?was?initially?identified?as?Streptomyces?strain，?tentatively?named?Streptomyces?sp.?ZMD1.?ZMD1?strain?can?be?used?as?a?good?reserve?material?for?the?development?of?biocontrol?agents?for?tobacco?diseases，soil?conservation?agents?and?special?fertilizer.

Key?words?Tobacco;Rhizosphere?soil;Biocontrol?bacteria;Classification?and?identification

基金项目?河南省烟草公司驻马店市公司项目“植烟土壤的微生物定向调控保育技术研究”;河南省高等学校重点科研项目（16A180003）。

作者简介?唐培培（1990—），女，河南沈丘人，硕士，从事烟草学研究。通信作者，硕士，从事烟草栽培学研究。

收稿日期?2019-10-01

聚酮化合物（polyketide，PK）是細菌、真菌和植物等生物体内一类具有天然生物活性的化合物，它是在生物体内聚酮合成酶（polyketide?synthase，PKS）的作用下合成的[1-3]。聚酮化合物是很多生防活性微生物的作用靶点，在诸多领域应用广泛，如医药、农业等领域，尤其是在获取创新药物和新颖次生代谢产物方面颇受关注[4-7]。因此，从不同环境筛选获取具有产聚酮合成酶活性的菌株仍然具有重要意义。

烟草是我国一种重要的经济作物，土壤条件和病害防控是影响烟草生长的重要因素，二者不但影响植株营养器官的形态建成，对烤烟品质也有着非常重要的影响[8-9]。目前，因烟草重茬和化肥施用造成的土壤劣变及病害流行虽有所缓解，但植烟前茬作物的连作及较高的化肥施用，致使土壤劣变的总趋势仍然是普遍存在的，烟草病害是产量和品质的严重威胁。在此背景下，植烟土壤保育和病害的防控就成了烟草生产技术研究的两个关键领域[10]。从烟草根际土壤中获取具有PKS活性的功能菌株鲜见报道，开展相关研究，无论是对PKS基因簇本身还是对微生物资源开发均具有积极意义。该研究拟从烟草根际土壤中分离产PKS菌株并进行鉴定。

1?材料与方法

1.1?材料

烟草根际土壤：采自驻马店市确山县烟田，取样深度20?cm。

分离培养基[11]：蛋白胨5?g、牛肉膏3?g、氯化钠10?g、琼脂粉20?g、蒸馏水1?000?mL，自然pH。LB培养基[11]：蛋白胨10?g、酵母粉5?g、氯化钠10?g、琼脂粉20?g、蒸馏水1?000?mL，pH?7.0。

1.2?菌株的分离培养

采用土壤微生物平板法分离技术[12]，获取细菌的活体纯培养物，保种备用。

1.3?分离菌株的抗菌活性判断

指示菌液的制备：从指示菌斜面上挑取一环接入3?mL?LB培养基，28?℃、转速180?r/min培养12?h。待测菌株发酵液的制备：将纯化出的菌株挑取一环接入LB培养基，28?℃、转速?180?r/min培养12?h后，取5?mL超声波破碎，备用。

采用纸片法[4，11]测定待测菌株对金黄色葡萄球菌的抗性：向培养皿中倒入20?mL灭菌LB培养基，凝固后加入100?μL（1.0×107?CFU/mL）的金黄色葡萄球菌菌液，涂布，静置5?min。将圆形纸片置培养皿表面，纸片滴加待测菌发酵液，静置5?min，于28?℃培养24?h观察抑菌圈情况。

待测菌株对烟草黑胫病病原的抑制作用测定：在LB平板中央接种烟草黑胫病病原菌块，在距培养皿边缘约9?mm处放置灭菌圆形制片，每个纸片滴加一滴待测菌株发酵液，静置5?min，28?℃恒温培养7?d，期间每隔24?h在纸片上滴加一滴待测菌株发酵液。

1.4?菌株PKS基因的克隆验证

所用引物为PKS-Ⅰ?正：5′-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3′;反：5′-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3′，预期长度1?200～1?400?bp。PKS-Ⅱ?正：5′-GGCAGCGGTTTCGGCGGTTTCCAG-3′;反：5′-CGTTGTTTACTGCGTAGAACCAGGCG-3′，预期长度492～630?bp[13]。采用TaKaRa?DNA?Extraction?kit?Ver.2.0提取菌株基因组DNA，PCR扩增体系和反应条件参考文献[11]进行。PCR产物胶回收后连接TaKaRa?pMDTM18-T?Vecter载体并转化于DH5α，挑选阳性克隆送测，测序由北京奥克鼎盛生物科技有限公司完成。

1.5?菌株的分类鉴定

应用光学显微镜和扫描电子显微镜对菌株形态进行观察[14]。根据形态特征观察和文献报道，拟定生理生化特征测定项目，操作步骤参考工具书记载的方法进行[15-16]。

16S?rDNA的克隆：以待测菌株基因组DNA作为模板，选用引物，正：5′-CCGTCGACGCTCAGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′，反：5′-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。操作参考文献[11]进行。

2?结果与分析

2.1?目标菌株的获得及其抑菌活性评估

从烟草根际土壤中分离获得一株菌株，将其编号为ZMD1，划线纯化后，甘油-40?℃保存。

采用纸片法考察ZMD1菌株对金黄色葡萄球菌和烟草黑胫病病原的抗菌活性。试验结果表明，ZMD1菌株对金黄色葡萄球菌和烟草黑胫病病原具有明显的抑菌圈（图1a、b），说明其存在拮抗病原菌的活性物质。故初步推断ZMD1可能具有聚酮合成酶活性。

2.2?ZMD1的PKS基因克隆验证

以ZMD1菌株的基因组DNA为模板，分别采用PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ的兼并引物进行PKS基因的PCR扩增，结果显示，PKS-Ⅰ（图2a）和PKS-Ⅱ（图2b）均能扩增出清晰的目标产物条带。将PCR产物进行克隆测序，测序结果与GenBank中已知PKS序列进行比对，测序获得的PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ与其他种PKS序列的相似度都超过95%，故确定ZMD1菌株含有PKS基因功能。

2.3?ZMD1菌株的鉴定

2.3.1?ZMD1菌株的形态特征。

对ZMD1菌株的观察表明，菌株在牛肉膏蛋白胨培养基和LB培养基上均生长良好，28?℃条件下培养4?d形成菌落，小而致密，干燥，边缘粗糙，凸出，早期呈白色，后期逐渐呈土黄色，不透明（图3a）;扫描电镜观察可知，菌体呈链状，长短不一，孢子丝端部钝圆，表面具疣（图3b）。从一般形态特征上初步判断为链霉菌。

2.3.2?ZMD1菌株的生化特性。

生理生化测定结果表明，ZMD1为革兰氏阳性菌，20～40?℃温度下均能生长，对NaCl的耐受浓度可达60?g/L，耐酸碱范围5～9。其他测定项目呈阴性的有硝酸盐还原、尿素利用、纤维素分解、牛奶胨化、色氨酸分解、甘氨酸利用、酯酶分解、山梨醇利用、L-组氨酸利用、L-色氨酸利用和胶醛糖利用;呈阳性的有明胶液化、淀粉水解、M.R.试验、硫化氢试验、牛奶凝固、L-谷氨酸利用、肌醇利用、甘油利用、L-酪氨酸利用;可利用葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖作为糖源。ZMD1生化特征与文献中对链霉菌属的描述基本一致[13，17]。

2.3.3?ZMD1的16S?rDNA分析。

以ZMD1菌株DNA为模板进行?PCR扩增，将目的带胶回收以后进行克隆测序，获得ZMD1菌株的16S?rDNA序列，长度为1?474?bp。将获得的序列提交NCBI在线平台进行比对，挑取近缘的模式菌对应序列，以Escherichia?coli?11775T为外类群，采用Mega6.06构建目标菌株ZMD1的进化树（图4），聚类分析结果表明，ZMD1菌株与链霉菌属（Streptomyces）的Streptomyces?longisporus?5166T聚为一支，相似度为93%，说明它们不属于同一种。综合形态、生化及16S?rDNA聚类结果，暂将ZMD1归为链霉菌属（Streptomyces），暂命名为Streptomyces?sp.ZMD1。

3?討论

该研究采用牛肉膏蛋白胨培养基从烟草根际土壤中分离到ZMD1株菌，通过指示菌株的拮抗试验和对PKS基因的克隆验证，初步断定该菌株存在聚酮合成酶基因，丰富了功能野生菌株资源，也为PKS基因的后期深入研究奠定了一定的基础。因为ZMD1来自烟草根际环境，该菌株在后期开发利用过程中更容易在植烟土壤形成自己的生态位，进而更有效地发挥调控、生防和保育等作用。该研究选取烟草黑胫病病原作为指示菌株，主要是基于该病原菌在不同植烟区均具有较高的侵染率，是烟草栽培中发病率较高的病害[8，10]，将其作为指示菌株便于分离菌株的后期开发利用;选取金黄色葡萄球菌作为另一种指示菌株，则是因为金黄色葡萄球菌是一种分布极为广泛的原核致病菌，侵染寄主种类多，是原核致病菌的典型代表。另外，聚酮类化合物作为一类抑菌化合物，具有较广的抑菌谱[18]，烟草黑胫病菌侵染胁迫严重的烟草根际土壤产聚酮合成酶活性菌株更容易被激活而发挥作用，也更容易获得具有聚酮合成酶活性的菌株;PKS基因克隆验证的结果也进一步说明该试验分离到的ZMD1确实含有聚酮合成酶基因。该研究获得的结果相互印证，为ZMD1在烟草病害生防菌开发、土壤保育剂开发和专用制剂开发的后期研究提供了较大的参考价值。

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