杨斯锦 潘超 朱力 王恒樑 马莲菊

    摘要?Toll样受体2（TLR2）是Toll样家族中识别配体范围最大的一类Toll样受体（TLR），能够识别包括脂蛋白、脂肽等成分在内的多种配体。通过这些配体激活后的TLR2可以在免疫系统中发挥重要作用，引发特异性免疫反应。通过简要综述近年来对TLR2配体激动剂作为潜在的疫苗佐剂及免疫类药物方面的研究，发现其在免疫反应过程中的优势将为解决疫苗研发中的多种挑战发挥至关重要的作用。

    关键词?TLR2;免疫反应;疫苗佐剂

    中图分类号?R392文献标识码?A文章编号?0517-6611（2020）07-0007-04

    doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.003

    开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

    Research?Progress?of?Tolllike?Receptor?2?Agonists?in?Vaccine?Development

    YANG?Sijin1，2，PAN?Chao2，ZHU?Li2?et?al

    （1.?College?of?Life?Science，?Shenyang?Normal?University，Shenyang，Liaoning?110034;2.?Institute?of?Biological?Engineering，?Academy?of?Military?Medical?Sciences，Beijing?100071）

    Abstract?Tolllike?receptor?2?（TLR2）?is?the?Tolllike?receptor?（TLR）?with?the?largest?range?of?recognition?ligands?in?the?Tolllike?family.?It?can?recognize?a?variety?of?ligands，?including?lipoproteins?and?lipopeptides.TLR2?activated?by?these?ligands?can?play?an?important?role?in?the?immune?system，?triggering?a?specific?immune?response.Through?a?brief?review?of?recent?studies?on?TLR2?ligand?agonists?as?potential?vaccine?adjuvants?and?immune?drugs，?it?is?found?that?their?advantages?in?the?immune?response?process?will?play?a?vital?role?in?solving?many?challenges?in?vaccine?development?.

    Key?words?TLR2;Immune?response;Vaccine?adjuvant

    基金項目?辽宁省教育厅基础研究项目（LJC201912）。

    作者简介?杨斯锦（1995—），女，辽宁锦州人，硕士研究生，研究方向：资源与应用微生物学。通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事资源与应用微生物学研究。

    收稿日期?2019-11-18

    I型跨膜蛋白Toll样受体（Toll?like?receptor，TLR）家族的TLR2是一类位于细胞表面，常与TLR1或TLR6形成异源二聚体的模式识别受体。当这类受体与其配体结合时，可以启动先天性免疫反应，进而激活特异性免疫系统。因此，可以识别TLR2的配体即为激活TLR2的激动剂，这些激动剂在疫苗的免疫应答过程中起着重要作用。TLR2配体在免疫反应中可以调节APC细胞的迁移及抗原的内化、调控Ⅱ类MHC分子中抗原的加工和呈递、诱导CD4+?T细胞的极化以及激活NK细胞活性等。由此可见，TLR2通过其配体激活可以启动和传导与免疫相关的多种细胞信号通路，这可以成为药物开发和疾病预防的重要靶点[1]。

    现研究表明，TLR2可以识别脂蛋白、脂多肽、脂磷壁酸、阿拉伯甘聚糖以及酵母多糖等多种成分[1]。TLR2通过对这些物质激活的响应，可以促进炎性细胞因子的产生并且诱导特异性免疫。

    目前比较常见的疫苗主要为减毒活疫苗和灭活疫苗，然而这2种疫苗都存在着可能回复到致病形式或灭活不足的安全隐患，因此，佐剂的使用既可以增强免疫原性又可以减少抗原的总量和达到所需免疫水平的免疫次数。TLR2激动剂可广泛应用于疫苗的佐剂研究，以诱导长效而持久的免疫应答[2]。为充分利用TLR2激动剂在免疫系统中的重要功能，现已将TLR2激动剂开发为潜在的疫苗佐剂及抗肿瘤类的药物，例如从传统来看，癌症的常规治疗方式为化学疗法，即放射疗法和手术相结合，虽然这种方法可以导致肿瘤的消退和生命的延长，但是这样的技术是侵入性的，极易引发副作用并且这种治疗形式大多数都是持久性的。近年来，免疫治疗作为一种新的治疗方式已经引起人们的关注，其中TLR2及其激动剂已被用于抗原及免疫增强剂，旨在恢复和增强机体受损的免疫系统对抗癌症，这些研究为开发用于治疗疾病（尤其是癌症）的新型免疫治疗剂提供了巨大的潜力[3]。笔者主要通过对TLR2在免疫系统中发挥作用的过程及原理等方面进行分析，总结了其在疫苗研发中的重要作用。

    1?TLR2及其配体

    与膜相关的TLR是模式识别受体（pattern?recognition?receptors，PRRs）的一种，它们可以帮助先天性免疫系统感知微生物。由于病原体相关分子模式（PAMP）刺激PRRs在后续特异性免疫应答的形成过程中起决定性的作用，包括抗原提呈细胞的成熟、初始T细胞的激活和炎性细胞因子的诱导，所以在PRRs配体中抗原的结合已成为一个重要的免疫学研究方向，而TLRs即为研究最广泛的模式识别受体之一[4-5]。

    在系统发育中，TLR2属于TLR家族，它位于细胞表面，与其配体结合后，可以和同一家族的TLR发生二聚，在抗原提呈细胞（包括巨噬细胞、树突细胞、单核细胞）中表达。TLR2通常被描述为识别配体范围最大的TLR，这些配体包括细菌细胞壁中的成分，如脂蛋白、肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）、某些细菌物种（如牙龈卟啉单胞菌）的脂多糖（LPS）、奈瑟菌的孔蛋白、分枝杆菌的脂蛋白-甘露聚糖和酵母聚糖以及酵母细胞壁中的磷酸脂甘露聚糖等[6]。将TLR2激动剂共价结合到抗原上，能够使与TLR2靶向的脂质分子结合的抗原直接或交叉呈递表达过程增强、调节Th反应的平衡，以及刺激TLR2的黏膜印迹特性，这些都有可能有利于帮助解决实际的疫苗问题。

    2?依赖于细菌蛋白TLR激动剂的TLR2受体激活

    通常认为TLR激动剂大多数都为非蛋白微生物成分，如脂多糖、寡核苷酸、脂肽。但是，越来越多的研究表明，许多细菌蛋白同样可以激活TLR信号和免疫反应。这些TLR激动剂的蛋白呈现了一些非蛋白TLR激动剂所没有的独特特性，包括蛋白佐剂可与蛋白抗原在基因上融合，保证佐剂和抗原在同一细胞内的同时一同被运输，从而更有效地激活先天和特异性免疫。

    TLR2可以与TLR1或TLR6结合形成异二聚体，分别识别三酰化脂蛋白和二酰化脂蛋白[6]。众所周知，大部分的脂蛋白都位于外膜上，即使脂蛋白的浓度在非常低时也可以被TLR2所识别，迅速地启动相应的级联信号，从而促进胞内配体识别信号的转导，激活下游信号通路，最终诱导促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子和趋化因子的大量产生，并促进宿主免疫细胞的成熟与分化。

    除脂蛋白外，TLR2还对包括脂多肽、脂壁酸、阿拉伯甘聚糖及酵母多糖在内的多种微生物模式产生响应，表明TLR2具有混杂的特性[6]。志贺氏菌和沙眼衣原体的外膜蛋白（OMPs）可以诱导TLR2信号转导。这些OMPs引起促炎细胞因子IL-12p70、TNF-α、IL-6在APC上诱导成熟标记，在体腔和黏膜腔内诱导产生抗原特异性IgG和IgA，并协调细胞（Th1极化）介导的免疫应答[7-9]。细菌空隙形成蛋白是另一种与TLR2信号转导有关的外膜蛋白，研究表明多种细菌的孔蛋白都被鉴定为TLR2信号转导的激活物，例如，痢疾志贺氏菌的Ⅰ型孔蛋白可以上调TLR2的表达，并通过对TLR2的刺激诱导T细胞的增殖和存活[10];在霍乱弧菌中阻断作为PAMP的外膜孔蛋白OmpU对TLR2的激活，会影响M1相关促炎细胞因子的产生[11];乳酸奈瑟氏菌的PorB是TLR2的配体，二者的相互作用对于驱动TLR2/TLR1依赖性细胞應答至关重要，并且被研究者认为是通过孔的表面暴露环区域发生的[12]，此外，门氏奈瑟氏菌的外膜蛋白也是天然存在的TLR2配体，并可以起到佐剂的作用[13];梭状芽孢杆菌的FomA能够诱导野生型原代B细胞中表达TLR2[14]等。这些蛋白都可以诱导促炎细胞因子，激活APC进而诱导细胞和体液免疫反应。除外膜蛋白外，其他多种不同类型的蛋白也表现出TLR2激动剂的功能。例如，流产布氏杆菌的重组布鲁氏菌细胞表面蛋白（rBCSP31）可与TLR2和TLR4相互作用，诱导IL12-p40、TNF-α和IL-6。当用rBCSP31激活后，与野生型巨噬细胞相比，TLR2和TLR4缺陷型巨噬细胞分泌的细胞因子水平较低。进一步的研究表明，rBCSP31可以TLR2和TLR4依赖性方式诱导Th1型免疫反应，防止流产双歧杆菌感染[6]。分支杆菌蛋白MymA同样也是TLR2的激动剂，它可以诱导人单核细胞衍生出的巨噬细胞产生抗原提呈细胞的功能，包括上调CD40、CD80、CD86和HLA-DR的表达，以及IL-12和TNF-α的分泌。除此之外，MymA还通过增加INF-γ的分泌使宿主对Th1的免疫反应极化[15]。

    3?通过靶向TLR2的制剂进行免疫调节

    在开发亚单位疫苗的过程中，怎样更好更合理地使用TLR激动剂依赖于对免疫刺激在特异性免疫机制中是如何被启动的研究。通过PRR进行的先天激活在适应性免疫的形成过程中起着核心作用。

    研究表明，TLR配体可短暂降低DC细胞在炎症部位的运动性，使DC细胞与抗原在炎症部位的接触时间延长[16-17]。此外，病原体的内化也受炎症部位的TLR激活的调节，通过响应TLR配体的反应，抗原的内在化最初出现短暂的增加，然后是成熟DC的内吞能力特征性降低，这与专门用于抗原加工和提呈的表型是一致的[18-20]。当刺激包括TLR2在内的不同TLR时，都可以观察到DC细胞运动的短暂减少和抗原内化的增强[21]。

    尽管仍然存在争议，但越来越多的证据支持TLR激活在吞噬体成熟过程中起决定性作用，从而影响APCs对抗原摄取和加工处理的调控。Blander等[22-24]研究发现吞噬体成熟存在2种模式，一是组成型的，二是由TLR信号诱导和调控的。根据研究发现，只有在存在TLR配体的吞噬体中存在吞噬体融合速度高于凋亡细胞吞噬作用速度的现象。除此之外，当抗原与TLR配体共价连接或与同一物理颗粒结合时，TLR激活对吞噬体成熟和MHCⅡ类负载的自主调控可以增强特异性免疫调控反应，这充分证明TLR激活可以自主调控MHCⅡ类的负载并稳定细胞表面的Ⅱ类MHC[23，25]。TLR2作为TLR家族的一员也不例外，在存在TLR2激动剂即当抗原与脂蛋白或脂肽共价连接时，体内可以明显观察到抗体和细胞应答的增加。

    有关TLR2激活和在疫苗接种中使用TLR2靶向制剂最有争议的一点就是在CD4+?T细胞极化过程中不同TLR配体的TLR激活结果不同。在Dillon等[26]提出的模型中受体的激活诱导了高水平的ERK1/2信号转导，因此稳定转录因子c-Fos，抑制IL-12的产生并促进IL-10的分泌，从而有利于Th2反应的响应。此外，根据Imanishi等[27]的研究，TLR2配体对小鼠Th1细胞的刺激直接诱导IFN-γ的产生以及在没有TCR刺激的情况下细胞的存活和增殖;在其他的TLR配体中没有观察到相同现象，因此，研究者们认为被激活后的TLR2或使用由TLR2激动剂组成的佐剂通过APC激活有效诱导Th1反应。研究证明，TLR2既起诱导作用，又起调节作用。通过激活TLR2，使它单独发挥作用或与其他刺激物联合使用，对体内的免疫反应机制具有重要影响。

    现已证明NK细胞的活化依赖于TLR2是否被激活，活化的NK细胞在针对不同病毒和细菌的免疫应答中起作用，这表明TLR2激动剂可以作为治疗或预防性免疫调节中NK细胞活性诱导剂的可能性[28-32]。尽管对TLR2激动剂诱导NK细胞活化过程中所需要的辅助性细胞（DCs）和辅助性细胞因子仍有待商榷，但已证明了不同TLR2激动剂对NK细胞都具有激活作用，TLR2介导的NK活性激活已形成适应性应答，以及在召回应答中激活NK细胞活性，这将会成为未来预防性疫苗开发的有趣研究。

    此外，TLR2在抗体应答发展中的特殊作用现在正在显现，已经证明TLR2对抗体分泌细胞的产生和寿命都有影响，因此，靶向TLR2的药物制剂被广泛描述为抗体应答的良好诱导剂。

    4?针对TLR2的免疫原性制剂

    TLR2是先天性免疫和适应性免疫之间的桥梁。近年来，TLR2激动剂已经被开发成为潜在的疫苗佐剂及抗肿瘤药物。

    在20世纪90年代报道了第一个用于与大肠杆菌中的细菌脂蛋白融合表达蛋白质的质粒载体，旨于开发疫苗。其中一些研究的唯一目的是在宿主细菌的表面展示抗原[33-34]，但也有一些研究是为了利用脂质部分的辅助特性来诱导免疫系统对异嗜性抗原的反应[35-36]。这些载体由来自细菌脂蛋白基因的部分或完整序列组成，其后为异源抗原的编码序列。在这些嵌合结构中用作伴侣或用作脂化信号源的脂蛋白中，包括铜绿假单胞菌的OprI脂蛋白，OprI基因在其末端通过克隆获得多接头修饰，通过修饰的结合脂蛋白在经过诱导后存在于外膜中，在不使用佐剂的情况下用于产生抗体[35];结核分枝杆菌的大小为26?kDa的脂蛋白（Rv1411），酰化的Rv1411是一種有效的TLR2受体激动剂，它与一种免疫原性蛋白融合，构建出的融合蛋白可以应用于提供有效且廉价的新型抗结核疫苗[37];脑膜炎奈瑟氏球菌的Ag473脂蛋白，Chen等[38]确定将至少包含Ag473?N端40个残基的序列与来自登革热病毒的非脂免疫原融合，以实现高表达水平的重组脂质免疫原，在而后的动物试验研究中也证明这种脂质免疫原能够引发更强的抗体中和反应;OMP19脂蛋白，外膜脂蛋白OMP19与来自牛分支杆菌的MPB83抗原融合形成的嵌合蛋白可以成功表达并准确地定位在预期的亚细胞部分中[39];大肠杆菌的Braun脂蛋白[40-41];来自由大肠杆菌产生的大肠杆菌素质粒中的大肠杆菌E2裂解脂蛋白[36];鳗弧菌的Wza脂蛋白[42]等。在这些脂蛋白中，除了来自结核分枝杆菌的Rv1411脂蛋白外，所有提及的脂蛋白均来自革兰氏阴性细菌，并发现它们都锚定在外膜上。这些分子首先在细胞质中表达为具有N末端信号肽的脂蛋白，然后通过Sec转座子穿过内膜转移到周质侧进行处理，最初的脂化步骤是通过硫醚键使二酰基甘油基团与位于成熟序列N端的半胱氨酸残基结合，接着裂解信号肽，然后第3个酰基链通过酰胺键连接到同一半胱氨酸残基的氨基上，成熟的脂蛋白通过Lol系统最终运输并固定在外膜上。此外，还有一些使用脂蛋白作为同源抗原的疫苗制剂实例，这些疫苗制剂是从其天然宿主中提取或在其他表达宿主中产生的。

    佐剂是能够提高疫苗的有效性但不直接参与免疫保护反应的物质，它除了可以增强免疫原性外，还可减少抗原的总量和达到足够免疫保护水平所需的免疫次数，因此，充分利用TLR激动剂可以诱导强效而持久的免疫应答的特点，TLR激动剂可以作为潜在的疫苗佐剂。与脂类分子连接的肽的化学合成是另一种广泛用于制备佐剂制剂的策略。抗原表位通过Pam3C和Pam2C模拟二酰化和三酰化的细菌脂质分子，但是这种结构也有许多不同的变体，包括单链棕榈酰肽、更复杂的脂质核心肽（LCP）和多抗原亲脂性辅助载体（MALAC）系统[43]，如HIV疫苗中的脂肽佐剂等。

    开发TLR2激动剂在寻找潜在的癌症免疫刺激剂方面具有巨大的潜力。与传统治疗方法相比，肿瘤免疫治疗因其潜在的特异性和无不良反应而受到越来越多的关注。TLR2激动剂通过S-[2，3-双（棕榈酰氧基）丙基]-半胱氨酸（Pam2Cys）基序而产生的脂肽，具有强大的免疫刺激作用，这些激动剂通过一种提供“危险信号”的方法以激活针对肿瘤抗原的免疫系统[3]。最近，Du等[44]基于hTLR2-hTLR1-Pam3CSK4复合物的晶体结构设计了一系列新的Pam3CSK4衍生物，合成并评估了其免疫刺激活性，在其研究中表明，人类和鼠类TLR2激动剂的活性与Pam3CSK4相当，包括IL-6表达水平升高、通过激活NF-kB信号通路，上调TNF-α和IL-6?mRNA的表达，促进DC细胞的成熟。另外一个需要考虑的要点是其中一些合成激动剂具有与典型细菌TLR2激动剂非常不同的肽和脂质结构，因此，TLR2的激活对其免疫调节特性的依赖仍有待研究。

    5?小結

    对TLR2的研究不仅提示了一些已有佐剂的效应机制，也将其本身的激动剂充分利用到了疫苗的研究与开发中，TLR2激动剂作为一类新的免疫制剂，通过在免疫反应中增强抗原呈递、激活免疫细胞等作用，有助于解决当前疫苗研究中的许多挑战。利用TLR2激动剂研发的疫苗佐剂和药物既可以减少不良反应的发生又可以更加精确的激活所需的免疫应答。相信随着对TLR2受体及其激动剂的更加深入研究，它在疫苗研发过程中将发挥出更加重要的作用。

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