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一株好氧反硝化苯酚降解菌的筛选和降解特性分析

范文

张峥何勍覃华静黄雪容邓冬梅

摘要?以苯酚为唯一碳源，通过富集培养方法从焦化废水生物处理系统的好氧池活性污泥中分离出1株既具有降解苯酚能力也具有反硝化功能的菌株C3。根据16SrDNA序列分析，C3菌株和Pseudomonas?sp.的16SrDNA序列相似性达99%。通过单因素和响应面法确定C3菌株的最优环境条件为pH?7.5、温度30?℃、初始苯酚浓度1.0?g/L、硝酸盐氮浓度1.0?g/L，在该条件下，C3菌株對苯酚的降解率为89.3%，对硝酸盐的降解率为81.3%，降解产物为N2。

关键词?Pseudomonas?sp.;苯酚;好氧反硝化;降解特性

中图分类号?X172文献标识码?A

文章编号?0517-6611（2020）07-0074-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.023

Screening?and?Characterization?of?Phenol?Degrading?Bacteria?with?the?Function?of?Aerobic?Denitrification

ZHANG?Zheng1，2，HE?Qing1，2，QIN?Huajing1，2?et?al

（1.College?of?Biological?and?Chemical?Engineering，Guangxi?University?of?Science?and?Technology，?Liuzhou，Guangxi?545006;2.Guangxi?Key?Laboratory?of?Green?Processing?of?Sugar?Resources，Liuzhou，Guangxi?545006）

Abstract?Using?phenol?as?the?sole?carbon?source，a?strain?C3?with?the?ability?of?degrading?phenol?and?denitrifying?was?isolated?from?the?activated?sludge?of?the?aerobic?tank?of?the?coking?wastewater?biological?treatment?system?by?enrichment?culture.According?to?16SrNDA?sequence?analysis，the?16SrDNA?sequence?similarity?between?C3?strain?and?Pseudomonas?sp.reached?99%.The?optimal?environmental?conditions?of?the?C3?strain?were?determined?by?single?factor?and?response?surface?methodology：?pH?7.5，temperature?30??℃，initial?phenol?concentration?1.0??g/L，nitrate?nitrogen?concentration?1.0?g/L.Under?these?conditions，the?degradation?rate?of?C3?strain?to?phenol?was?89.3%，the?degradation?rate?to?nitrate?was?81.3%，and?the?degradation?product?was?N2.

Key?words?Pseudomonas?sp.;Phenol;Aerobic?denitrification;Degradation?characteristics

基金项目

广西自然科学基金项目（2017GXNSFBA198099）;广西重点实验室基金项目（YB2014201，2016TZYKF10）;广西高校科学技术研究项目（YB2014201）;广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助（桂教人〔2014〕7?号）;2017年广西国家级大学生创新创业训练计划（201710594042）。

作者简介?张峥（1994—），男，河南南阳人，硕士研究生，研究方向：环境微生物。通信作者，副教授，博士，从事环境微生物方面研究。

收稿日期?2019-07-03;修回日期?2019-07-09

苯酚是环境中主要的水污染物之一，主要来源于煤气、印染、石油化工等制造业废水[1-2]，生物处理是目前废水中苯酚降解的主要途径[3]。研究表明，苯酚能被多种微生物降解，苯酚降解菌主要包括假单胞菌（Pseudonomonas.?sp）?[4]、酵母菌（Yeast?trichosporon）?[5]、芽孢桿菌（Bacillus.sp）?[6]、根瘤菌（Rhizobia）?[7]、白念珠菌（Candida?albicans）[8]等。为提高废水中苯酚的降解率，亟需筛选更多高效的苯酚降解菌。

好氧反硝化菌是一种新型反硝化菌，主要存在于芽孢杆菌属（Bacillus）、副球菌属（Paracoccus）、产碱杆菌属（Alcaligenes）和假单胞菌属（Pseudomonas）等，多数为好氧或兼性好氧，并以有机碳作为能源的异养硝化菌[9]。

研究表明，有些苯酚降解菌也具有反硝化功能，好氧反硝化苯酚降解菌的筛选可以为环境中苯酚和氮污染的治理提供有效菌源，也可为更深入探讨苯酚降解机理提供研究材料。但目前筛选出的具反硝化功能的苯酚降解菌不多。为此，该研究从焦化废水活性污泥中分离筛选得到1株好氧反硝化苯酚降解细菌，并对其进行鉴定。进一步研究该菌株的苯酚和硝酸盐降解及菌株生长情况，并考察环境因素对其苯酚降解能力的影响，为具有反硝化功能苯酚降解菌的实际应用提供理论依据。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?菌株。筛选自柳钢焦化废水生物处理系统好氧池中的活性污泥。

1.1.2?培养基。

细菌富集培养使用LB?培养基，包含蛋白胨?10?g/L、酵母膏?5?g/L、NaCl?10?g/L、苯酚（根据需要加入），pH?7.2～7.4。细菌分离和降解试验中，培养基为无机盐培养基（mineral?salt?medium，MSM[10]），包含4.26??g/L?Na2HPO4、0.20?g/L?MgSO4·7H2O、0.02??g/L?CaC12、0.05??mg/L?KI、2.00?mg/L?MnSO4·4H2O、0.20??mg/L?CuSO4·2H2O、2.00??mg/L?ZnSO4·7H2O、2.50??mg/L?Na2MoO4·2H2O、82?μg/L?H3BO3、1.00?mg/L?FeC13·6H2O、苯酚，pH?7.2～7.6。固体培养基为在液体培养基中投加15??g/L?琼脂。

1.2?方法

1.2.1?菌种的驯化和分离。

取10?mL新鲜活性污泥与90?mL无菌水混合振荡，取5??mL上清液至含不同浓度苯酚的LB培养基中富集培养24?h，培养液依次转移到含苯酚50、100、200、300、400、500?mg/L的MSM培养基中，30?℃，120?r/min条件下培养6?d。对生长最好的一组培养液菌液，在MSM培养基上进行涂布及平板划线分离，分离得到纯菌株，进一步对筛选的纯菌株在含苯酚的LB培养基中培养，测其苯酚降解率，确定其苯酚降解特性。对复筛确认有苯酚降解特性的纯菌株，保存在15%的甘油中，-80?℃保存备用。

1.2.2?菌种鉴定。对分离得到的苯酚降解能力最强的苯酚反硝化菌株C3进行革兰氏染色和16SrDNA测序，以确定其种属。16SrDNA测序时，首先利用细菌鉴定的通用引物27F?和1492R[11]对菌液进行PCR?片段基因扩增，引物由上海生工有限公司合成。反应体系（50?μL）包括：?25??μL?DNA?聚合酶mix，菌液模板4?μL，去离子水17?μL，上下游引物各2?μL。PCR温度程序为：94?℃预变性8?min，94?℃变性1?min，58?℃退火1??min，72??℃延伸1?min，循环29次，最后72?℃终延伸10??min，4?℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，纯割胶化PCR产物。将回收的DNA送往上海立菲生物技术有限公司广州分公司进行序列测定;将序列在NCBI网页上进行BLAST同源性比对。

1.2.3?菌株降解条件及降解特性研究。以苯酚降解率为指标，利用单因素试验研究pH、温度和初始苯酚浓度对菌株生长及降解苯酚的影响，根据环境单因素试验结果，用Design-Expert软件生成3水平3因素组合条件（表1），根据所生成的各组合条件摇床培养菌株，测定培养2?d后苯酚浓度，计算降解率，所得结果输入Design-Expert软件，进行分析。将C3菌在响应面法所确定的最优条件下进行摇床培养，每隔5?h测定苯酚浓度、硝酸盐和亚硝酸盐浓度以及菌液浓度，绘制生长曲线和苯酚降解曲线。

苯酚降解率=苯酚降解前浓度-苯酚降解后浓度苯醛降解前浓度×100%

1.2.4?分析方法。

菌种浓度的测定采用比浊法，使用分光光度计于波长600?nm?处测定其OD?值[12]。苯酚含量采用4-氨基安替比林分光光度法[11]测定;NO3--N含量利用二磺酸分光光度法测定;NO2--N含量利用N-?（1-萘基）-乙二胺光度法测定[13]。

2?结果与分析

2.1?苯酚降解反硝化菌筛选鉴定

通过富集、初筛和复筛得到1株革兰氏阳性的反硝化苯酚降解菌株C3，菌落灰白色、蜡质、圆形、边缘整齐平滑。C3菌株在pH=7、30?℃、120?r/min、苯酚浓度为1?000?mg/L条件下对苯酚降解能力达86%。革兰氏染色证明C3菌株为革兰氏阳性，对C3降解菌菌株的16SrDNA序列进行BLAST同源性比对，?发现其与Pseudomonas?sp.序列接近，同源性高达99%，因此初步鉴定该菌株为Pseudomonas?sp.（假单胞菌菌属）。目前研究表明，苯酚降解菌大部分属于假单细胞菌属[14]，但有关其反硝化能力的研究报道很少。

2.2?环境因素对菌株苯酚降解和反硝化能力的影响

2.2.1?pH对苯酚降解率的影响。

如图1所示，初始pH在6.5～8.0之间，C3菌体对苯酚均有一定降解率，pH=7.5左右时，C3对苯酚的降解率最高，达78%。图2表明，随着C3菌株对苯酚的降解，培养液中pH呈下降趋势，降解10?h后，pH由7降至5，苯酚降解菌Comamonas?testosterone中也发现类似的变化趋势[15]。这可能是因为苯酚降解菌在微生物降解苯酚时，需要将苯酚开环为有机酸，才能进一步为微生物利用，所以生长降解过程中培养液pH逐步下降呈酸性。

2.2.2?苯酚初始浓度对苯酚降解率的影响。图3表明，初始苯酚浓度为1?000?mg/L时，C3的苯酚降解率最大（99%）;苯酚浓度高于1?500?mg/L时，降解率呈缓慢下降趋势，但下降幅度不大;苯酚浓度为2?200?mg/L时，降解率依然高于80%。高浓度苯酚对C3苯酚降解速率的影响可能与苯酚对微生物的毒性有关。

2.2.3?温度对苯酚降解速率的影响。在20～30?℃之间，C3的苯酚降解速率随温度的增加而提高，温度高于30?℃时，苯酚降解率随温度的增加而降低，在25～35?℃苯酚降解速率较快。

2.2.4?响应面分析。

如表2所示，在设计的試验条件下，苯酚最大降解率达到89%，最小降解率为24%。

将表2?中的结果导入Design-Expert?软件，固定一个环境因素的情况下，以另外2个环境因素为X?和Y?轴，以降解率为Z?轴作图，得到不同降解条件下的苯酚降解率响应曲面。如图5所示，温度和底物浓度、pH和底物浓度、温度和pH对降解率的交互影响均不太显著。由图5还可知，C3菌株降解苯酚的最优条件为：温度30?℃、pH?7.5、底物浓度1?000?mg/L，在该条件下培养2?d后，对苯酚的降解效率达89%。

2.3?C3菌株生长曲线及降解特性

图6表明，培养28～32?h时，C3菌株进入对数生长期，菌株生长和苯酚降解及硝酸盐氮的消耗是同步的，培养60?h后，苯酚浓度从1?000?mg/L降解到107?mg/L，苯酚降解率达89.31%，，硝酸盐浓度从1?000?mg/L降解到187?mg/L，硝酸盐降解率达81.30%。C3菌株生长过程中伴有亚硝酸盐积累，其中开始生长时，亚硝

酸盐积累很少，但在接近对数期时有明显的积累，于28?h达到最大值660?mg/L，之后逐步下降，到第60?h，亚硝酸盐浓度降为50?mg/L。C3的硝酸盐降解及生长曲线符合好氧反硝化酶系理论，与已报道的好氧反硝化菌Diaphorobacter?sp.PDB3[10]相似。与Zhang等[16-17]报道反硝化细菌降解过程中也有亚硝酸盐的积累不一致，可能是因为初始硝酸盐降解为亚硝酸盐的速率高于亚硝酸亚降解速率，随硝酸盐浓度降低，硝酸盐降解为亚硝酸盐的速率逐渐降低。

3?结论

（1）以苯酚为唯一碳源，NO3-为唯一氮源，从焦化废水中筛选出了1株同时具有降解苯酚和反硝化能力的菌株C3，经16SrDNA测序鉴定为Pseudomonas?sp.。

（2）C3降解苯酚的最优条件为：pH?7.5、温度30?℃、初始苯酚浓度1?000??mg/L、硝酸盐氮浓度1.0?g/L，此时C3菌株的苯酚降解能力最高，在该条件下培养60?h后，C3苯酚降解率为89%，NO3-去除率达81%。

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