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标题

姜科植物的蛋白遗传多样性研究

范文

代亚坤王小星袁琳高炳淼

摘要?[目的]了解不同姜科植物蛋白水平遗传多样性。[方法]分别采用TCA/丙酮法、Tris-HCl法和试剂盒法提取益智叶片蛋白并进行聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）分析，获得最佳蛋白提取方法。采用最佳蛋白提取方法提取7种姜科植物的蛋白并进行SDS-PAGE分析和数据统计，用软件NTSYS对姜科植物进行聚类分析。[结果]试剂盒法为最佳蛋白提取方法，SDS-PAGE结果表明，7种姜科植物中共检出蛋白条带52个，其中共有条带14个和多态性条带38个，平均多态性比率为73.1%。聚类分析结果表明，7种姜科植物可分为4类，聚类结果与姜科植物的种属相关但并非严格一致。[结论]该研究建立了姜科植物的蛋白遗传多样性研究方法，表明姜科植物具有丰富的蛋白遗传多样性，为今后姜科植物的遗传多样性研究提供了理论依据。

关键词?姜科植物;蛋白;聚丙烯酰胺电泳;聚类分析

中图分类号?Q943?文献标识码?A

文章编号?0517-6611（2020）14-0195-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.055

Abstract?[Objective]To understand the protein diversity of different Zingiberaceae plants.[Method]The protein of?Alpinia oxyphylla?Miq.was extracted by TCA/acetone method，Tris-HCl method and kit method and analyzed by polyacrylamide electrophoresis （SDS-PAGE） to obtain the best protein extraction method.The proteins of seven species of Zingiberaceae plants were extracted by the best protein extraction method and analyzed by SDS-PAGE and statistical data.The clusters of Zingiberaceae plants were analyzed by software NTSYS.[Result]The kit method was the best protein extraction method.The results of SDS-PAGE showed that 52 protein bands were detected in seven species of Zingiberaceae plants，including 14 bands and 38 polymorphic bands.The average polymorphism ratio was 73.1%.The results of cluster analysis indicated that the seven species of Zingiberaceae plants could be divided into four categories，and the clustering results were related to the species of Zingiberaceae but were not strictly consistent.[Conclusion]This study established a method for studying the genetic diversity of Zingiberaceae plants，indicating that the Zingiberaceae plants have rich genetic diversity，which provides a theoretical basis for the future study of the genetic diversity of Zingiberaceae plants.

Key words?Zingiberaceae;Protein;SDS-PAGE;Cluster analysis

姜科（Zingiberaceae）是单子叶植物中的一个大科，分为2个亚科4族52 属，约1 500种，主要分布于热带、亚热带地区[1]。在我国，姜科植物主要分布在西南部和东南部的一些省份，有20属、216种[2-3]。姜科植物拥有较长的药用历史，它的药效通常是解表散寒、理气健胃[4]。其中，包含很多常用药材如益智和砂仁，并以“四大南药”而著称[5]。姜科植物的化学成分中均含有挥发油成分，因此有比较芳香的气味，除此之外还含有黄酮类、甾体皂苷类和双苯庚烷类等[6-8]。

姜科植物资源丰富，已有基于PCR扩增技术的分子标记如AFLP、ISSR、SRAP、ITS等研究姜科植物资源的遗传多样性[9-12]。目前关于姜科植物蛋白的遗传多样性研究尚未见报道，蛋白作为基因表达的直接稳定产物且受相关基因的严格调控，同样能在生化水平上反映遗传物质组成上的差异[13]。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）具有变性蛋白质可溶解、泳动速度只与分子量大小相关、与蛋白所带电荷和形态无关等特点[14]，成为一种有效工具已经被广泛应用于解决植物分类、进化问题及品种和变种的鉴定等方面[15-16]。

笔者通过优化蛋白提取方法，利用SDS-PAGE电泳技术对7种姜科植物的蛋白进行研究分析，获得蛋白的电泳指纹图谱，拟从蛋白水平探讨姜科植物的遗传多样性，旨在为姜科植物资源的分类、进化问题研究及品种鉴定等提供理论依据。

1?材料与方法

1.1?材料

1.1.1?供试样品。姜科植物样品均采集于中国医学科学院药用植物研究所（海南分所），由郑希龙副研究员负责鉴定（表1）。采集后的叶片加液氮研磨，置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2?试验试剂。

植物蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;考马斯亮蓝G-250购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3?试验仪器。PL602-S电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;WD-9405B水平摇床（沃德生物医学仪器公司）;Tanon-4100全自动数码凝胶图像分析系统（上海天能科技有限公司）;DYY-12型电泳仪（北京市六一仪器厂）;HHCP-01型二氧化碳培养箱（上海申贤恒温设备厂）。

1.2?方法

1.2.1?三氯乙酸（TCA）/丙酮法。TCA/丙酮法提取蛋白参照文献[17]。称取0.5 g姜科植物叶片放入研钵中，迅速加液氮研磨成粉末状，将粉末转入10 mL离心管中，加入6 mL预冷的10% TCA/丙酮溶液，涡旋混匀，-20 ℃沉淀若干小时。4 ℃ 15 000 r/min离心20 min，取上清液2 mL转移至10 mL 离心管中，加入3倍体积的预冷丙酮，充分混匀。4 ℃ 12 000 r/min 离心25 min，弃掉上清液后，抽真空挥发丙酮浓缩成干粉，加入100 μL的蛋白裂解液，使用超声波仪器使其溶解，得到蛋白液。

1.2.2?Tris-HCl法。Tris-HCl法提取蛋白参照文献[17]。称取0.5 g姜科植物叶片放入研钵中，加入其鲜重10%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，加入液氮充分研磨成粉末。将粉末转移至10 mL离心管中，加入其3倍蛋白提取缓冲液（68 mmol/L Tris-HCl pH 6.7，0.6 % SDS，10%甘油和3% β-巯基乙醇），振荡器振荡15 min后4 ℃放置1 h，充分溶解蛋白。4 ℃ 12 000 r/min离心25 min，取上清液2.0 mL转移至10 mL离心管中，加入6 mL预冷的丙酮，充分混匀，放入-20 ℃冰箱，沉降蛋白2 h，12 000 r/min离心15 min。取沉淀蛋白，抽真空挥发丙酮浓缩成干粉，加入300 μL电泳上样提取缓冲液（12.5% 0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，5% β-巯基乙醇和72.5% 的蒸馏水），使用超声波仪器溶解沉淀后，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min，取上清液备用。

1.2.3?试剂盒法。

称取0.5 g的姜科植物叶片，加入其鲜重10%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，用其3倍蛋白提取缓冲液（45.5 μL 1 mol/L Tris-HCl pH 6.8，5 mL 10% SDS，10 mL甘油，5 mL β-巯基乙醇，84.45 mL 蒸馏水）研磨粉碎后转移到2.5 mL离心管中，加入1 mL的蛋白裂解液后振荡混匀放置30 min（4 ℃），且每隔5 min左右就振荡一下，4 ℃ 12 000 r/min 离心30 min，取上清液备用。

1.2.4?聚丙烯酰胺电泳分析方法。

SDS-PAGE采用12%的分离胶和5%的浓缩胶，点样量为10 μL。在80 V恒压下电泳1 h后，调整电压120 V，继续电泳3～4 h。当指示剂到凝胶底部1.5 cm左右停止电泳。电泳结束后，将胶从玻璃板上剥离下来加入考马斯亮蓝染色液染色，再脱色，使胶的蓝色褪去并且有清晰可见的蛋白条带，用自动数码凝胶显像系统将脱色好的胶拍照保存并分析。

1.3?数据统计

根据电泳谱带进行统计时，有带记为1，无带记为0，形成原始数据矩阵。计数多态性带数，计算多态性带数百分率，并使用软件NTSYS基于遗传相似系数对各种姜科植物进行聚类分析。

2?结果与分析

2.1?蛋白提取方法分析?分别采用TCA/丙酮法、Tris-HCl法和试剂盒法对益智的总蛋白进行提取，并进行电泳以比较这3种方法的优缺点，结果如图1所示。由图1可见，试剂盒法提取蛋白条带和蛋白浓度的效果均优于TCA/丙酮法和Tris-HCl法;TCA/丙酮法和Tris-HCl法相对于试剂盒法具有耗时久、操作麻烦等缺点;BCA蛋白浓度测定试剂盒测定的蛋白浓度依次为：TCA/丙酮法2.7 g/L，Tris-HCl法4.6 g/L，試剂盒法8.2 g/L。综上所述，选用试剂盒法对所有姜科植物的蛋白进行提取。

2.2?姜科植物的蛋白电泳分析

7种姜科植物的蛋白经SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示。由图2可见，其分子量均分布在66.2～14.4 kDa。7种姜科植物中共检测出52个迁移率不同的蛋白条带，其中共有条带为14个，多态性条带38个，平均多态性比率为73.1%（表2）。7种姜科植物的蛋白谱带数因材料而异。其中，爪哇白豆蔻分离出的蛋白谱带数最多，共有11条蛋白条带，分别为6条明带和5条暗带;光叶山姜材料分离出的蛋白谱带数最少，只有5条蛋白谱带且均是暗带;草豆蔻和高良姜的蛋白谱带分布非常相似，主要蛋白谱带均有7条，分别为2条明带和5条暗带;益智和砂仁的蛋白谱带均有8条，其差异是益智在97.4 kDa的附近有1条蛋白暗带，砂仁在22.0 kDa附近处有1条蛋白暗带。

2.3?聚类分析

利用软件NTSYS对7种姜科植物进行聚类分析，结果见图3。由图3可见，其遗传相似系数变异范围在0.50～1.00，以遗传相似系数0.87时，可以分为4类：光叶山姜、阳荷和爪哇白豆蔻各自为一支，草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁则聚为一支。光叶山姜和其他6种姜科植物的遗传相似系数较小，表明亲缘关系较远。益智和砂仁聚在一组，遗传相似系数较大，约为0.90，表明亲缘关系较近。草豆蔻和高良姜聚为一类，遗传相似系数为1.00，表明草豆蔻和高良姜无法区分，其两者蛋白之间差异最小。

3?结论与讨论

海南岛姜科资源丰富，探究姜科植物资源的蛋白遗传多样性，阐明不同姜科植物种质资源的亲缘关系，可为姜科植物品种鉴定和保护提供理论依据，进而推动姜科资源更深层的开发利用[18]。该研究通过优化蛋白提取方法，采用SDS-PAGE电泳技术对7种不同的姜科植物蛋白遗传多样性进行了初步研究。结果表明，试剂盒法提取的蛋白效果最佳，姜科植物在蛋白水平上具有丰富的遗传多样性，可作为评价姜科植物遗传多样性的生化标记。

蛋白遗传多样性研究是以SDS-PAGE电泳的蛋白條带数、迁移位置、条带颜色深浅作为评价指标，受到蛋白提取方法的影响比较大[19]。为避免这种误差的影响，该研究以益智为材料进行蛋白提取方法的优化。结果表明，试剂盒法提取的蛋白电泳条带更多且清晰，而TCA/丙酮法和Tris-HCl法提取的蛋白电泳条带少且不清晰。BCA蛋白浓度测定结果表明，蛋白浓度依次从大到小为试剂盒法>Tris-HCl法>TCA/丙酮法。因此，选用试剂盒法提取姜科植物蛋白是比较切实可行的方法。

SDS-PAGE电泳结果表明，7种姜科植物的蛋白分子量均分布在66.2～14.4 kDa，共检测出52个迁移率不同的蛋白谱带，其中共有条带为14个，多态性条带38个，平均多态性比率为73.1%。从聚类分析结果来看，以遗传相似系数0.87时可将7种姜科植物分为4类：光叶山姜、阳荷和爪哇白豆蔻各自为一支，草豆蔻、益智、高良姜和海南砂仁则聚为一支。光叶山姜和其他6种姜科植物的关系最远，益智和砂仁的关系最相近，而草豆蔻和高良姜则无法区分。草豆蔻、高良姜和益智均属于山姜属植物，亲缘关系较近，虽然光叶山姜也同属山姜属，但其亲缘关系较远，与Kress等[20]对姜科植物的聚类分析结果一致。白豆蔻和砂仁同属豆蔻属，但亲缘关系较远，而海南砂仁与山姜属益智亲缘关系较近，与目前临床上常出现砂仁和益智仁混伪品的现象相符合[21]。因此，笔者通过SDS-PAGE电泳技术对7种姜科植物的多样性进行研究，建立了姜科植物蛋白遗传多样性的研究方法，为其他姜科植物的蛋白遗传多样性研究、图谱鉴定、聚类分析等奠定了基础。

参考文献

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