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标题

超高效液相色谱—串联质谱法测定动物源性食品中甲基睾丸酮残留量

范文

周迎春++王林裴++刘少博++华向美++刘会凌++彭新然

摘要：基于降低样品的基质效应、提高回收率和方法效率，建立采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法测定动物源性食品中甲基睾丸酮残留量的方法。分别对样品的提取溶剂和净化方法进行优化，然后用UPLC-MS/MS仪进行测定，外标法定量。结果表明：采用乙腈作为提取溶剂、C18固相萃取柱经甲醇活化后直接上样，且上样量为5 mL时的净化效果最佳。在此条件下，甲基睾丸酮在1～50 ng/mL范围内的线性关系良好，R2≥0.998，方法检出限为0.3 μg/kg，定量限为

1.0 μg/kg；以甲基睾丸酮的添加量分别为1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的水平进行方法学验证，回收率在70.60%～112.41%之间，相对标准偏差（relative standard deviations，RSD）为4.33%～9.26%。本方法操作简便、成本低、灵敏度高，适用于批量动物源性食品中甲基睾丸酮的残留量检测。

关键词：甲基睾丸酮；超高效液相色谱-串联质谱；动物源性食品；固相萃取

Determination of Methyl Testosterone Residues in Foods of Animal Origin by Using Ultra Performance

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHOU Yingchun1， WANG Linpei1， LIU Shaobo2， HUA Xiangmei1， LIU Huiling1， PENG Xinran1

（1.Luohe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Luohe 462300， China；

2.Cargill Food （Luohe） Co. Ltd.， Luohe 462300， China）

Abstract： An efficient method for the determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin with low matrix effect and high recovery was presented by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS-MS）. Samples were extracted with acetonitrile， and the extract was cleaned up on a C18 solid phase extraction column （SPE-C18）， concentrated by nitrogen gas blowing， detected by UPLC-MS-MS and quantitated by external standard method. The calibration curve for methyl testosterone exhibited a good linearity with R2 higher than 0.998. The limit of detection （LOD） was 0.3 μg/kg， and the limit of quantification （LOQ） was 1.0 μg/kg. The recoveries of methyl testosterone in spiked samples were in the range of 70.60%–112.41% at spiked levels of 1.0， 2.0， 10.0 and 40.0 μg/kg， with relative standard deviations （RSD） between 4.33% to 9.26%. This method was simple， low-cost， sensitive and suitable for the batch determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin.

Key words： methyl testosterone； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry； foods of animal origin； solid phase extraction

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011

中圖分类号：O657.6 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2017）09-0063-06

引文格式：

周迎春，王林裴，刘少博，等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中甲基睾丸酮残留量[J]. 肉类研究， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pub

ZHOU Yingchun， WANG Linpei， LIU Shaobo， et al. Determination of methyl testosterone residues in foods of animal origin by using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2017， 31（9）： 63-68. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201709011. http：//www.rlyj.pub

甲基睾丸酮属于人工合成雄性激素，在动物的苗种培育[1-2]和性别控制等方面作用明显[3-5]，但长期摄入可使畜、禽、鱼类机体产生慢性或蓄积毒性，扰乱激素平衡，造成免疫力下降[6]、畸形[7]、死亡等[8-9]。2003年，我国将甲基睾丸酮列为禁用兽药，然而由于甲基睾丸酮可以提高养殖产量，因此仍有不法分子在使用。2016年，我国国家质量监督检验检疫总局将甲基睾丸酮列为动物源性食品的法检项目。目前，水产品及饲料中甲基睾丸酮残留量的测定方法已经比较成熟[10-11]，主要包括液相色谱法[12-14]、液相色谱-质谱联用法[15-19]及酶联免疫法[20]；然而现有的动物源性食品中甲基睾丸酮残留量的测定方法往往有许多不足之处，例如提取过程繁琐、有机试剂用量大、环境污染严重，且不能有效降低基质效应，导致回收率较低，影响测定的准确性。本研究针对更好地降低基质效应、提高回收率等方面进行改进，建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）仪测定动物源性食品中甲基睾丸酮残留量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

动物源性食品由河南进口肉类指定口岸漯河查验区提供。

甲基睾丸酮标准品（纯度97.6%）德国Dr.Ehrenstorfer公司；C18固相萃取柱美国Agilent公司；

甲酸（质谱纯）、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（均为色

谱纯）美国Fisher Scientific公司；实验用水均为超纯水；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

6470型超高效液相色谱-串联质谱仪美国Agilent公司；VX-Ⅲ型涡旋振荡器北京踏锦科技有限公司；5810R型离心机德国Eppendorf公司；5982-9110型固相萃取装置美国Agilent公司；N-EVAP型氮吹仪

美国Organomation公司；KQ 5200DE型数控超声波清

洗器昆山市超声仪器有限公司；XPE 205型分析天平（感量0.01 mg）瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

从动物源性食品样品中取出有代表性可食部分，质量不低于500 g，用组织捣碎机充分捣碎、混匀，装入洁净的自封袋中，备用。

1.3.2 样品前处理

准确称取捣碎的样品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯离心管中，加入10 mL提取溶剂，涡旋振荡10 min，超声提取20 min，4 000 r/min离心5 min，吸取上清液，待净化。其中分别选取甲醇、乙腈和乙酸乙酯作为提取溶剂，比较不同提取溶剂对样品的提取效果。

1.3.3 样品提取液的净化

分别采用冷冻法、固相萃取法和分散固相萃取法对样品提取液进行净化，比较不同净化方法的效果。

冷冻法[21]：将待净化上清液置于-18 ℃冷冻6 h后取出，1 000 r/min离心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴条件下用氮气吹干，残渣用乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，待UPLC-MS/MS检测。

固相萃取法[22]：用3 mL甲醇对固相萃取柱进行活化后，加入5 mL待净化上清液，立即收集流出物，再用3 mL甲醇进行洗脱，收集洗脱液；将全部洗脱液在40 ℃水浴条件下用氮气吹干，残渣用乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，待UPLC-MS/MS检测。

分散固相萃取法[23]：将1.0 g C18粉末加入待净化上清液中，振荡5 min，4 000 r/min离心5 min，吸取5 mL上清液，在40 ℃水浴条件下用氮气吹干，残渣用乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容至1.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤后，待UPLC-MS/MS检测。

1.3.4 标准曲线的绘制

甲基睾丸酮标准溶液的配制：将甲基睾丸酮标准品用不同体积的乙腈-0.1%甲酸溶液（10∶90，V/V）定容，配制成甲基睾丸酮质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的标准溶液。

以甲基睾丸酮的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，外标法定量。

1.3.5 色谱条件

Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱温35 ℃；进样量2.0 μL；流动相梯度洗脱程序如表1所示。

1.3.6 质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式；多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）模式；干燥气温度300 ℃；干燥气流速6 L/min；毛细管电压3 500 V；其他质谱参数如表2所示。

目标化合物的定性依据：待测样品中目标化合物色谱峰的保留時间与标准溶液相比，变化范围应在±2.5%之内。甲基睾丸酮的定量离子与定性离子丰度比在（100±20）%之间则为阳性。

1.3.7 样品提取及净化效果的评价指标

基质校准溶液的配制：1）取不同体积的甲基睾丸酮标准溶液，加入将空白样品按照1.3.2、1.3.3节提取和净化所得的净化液，定容，配制成甲基睾丸酮质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基质校准溶液；2）准确称取捣碎的样品（0.500±0.002） g于50 mL聚丙烯离心管中，加入不同体积的甲基睾丸酮标准溶液，按照1.3.2、1.3.3节进行提取和净化，配制成甲基睾丸酮质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL的基质校准溶液。

按照公式（1）～（3）计算样品的基质效应（matrix effect，ME）、回收率（recovery，RE）及方法效率（method efficiency，PE）。ME值越小，表明样品的基质效应越严重[24-27]。

（1）

（2）

（3）

式中：A为用乙腈-0.1%甲酸溶液配制的甲基睾丸酮标准溶液的响应值；B为用空白样品净化液配制的甲基睾丸酮标准溶液的响应值；C为空白样品中添加甲基睾丸酮标准溶液后进行提取和净化的响应值。

1.4 数据处理

使用安捷伦UPLC-MS/MS仪自带的Mass Hunter数据处理软件对所采集数据进行处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 样品提取及净化条件的优化

2.1.1 提取溶劑的选择

提取溶剂影响样品的ME、RE和PE[28-29]，由表3可知，3 种提取溶剂中乙酸乙酯的ME最大，RE及PE最低，这可能是由于乙酸乙酯的极性较弱，在萃取甲基睾丸酮的同时溶解了大部分的脂肪等非极性化合物，因此对目标化合物造成了干扰；与甲醇相比，乙腈的RE降低了2.01%，但ME值和PE分别升高了3.57%和2.83%，因此选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 净化方法的选择

ME是定量分析中必须考虑的因素[30]，采用冷冻法、固相萃取法或分散固相萃取法等方式对样品进行净化均有助于降低ME。脂肪在动物源性食品中占比最大，可能是造成ME的主要因素。由表4可知，3 种净化方法均降低了样品的ME，其中固相萃取法的ME最小，且RE和PE最高，这可能与C18固相萃取柱具有更好的除脂效果有关。因此选用固相萃取法对样品进行净化，同时进一步优化实验方法以降低ME。

2.1.3 样品净化上样量的确定

在保证灵敏度的前提下，对样品进行适当稀释有助于降低ME[31]，同时减少净化时的上样量有助于提高固相萃取柱的净化效果，因此，分别选择上样量为5 mL和10 mL提取液进行固相萃取净化。由表5可知，净化时的上样量为5 mL时可以明显降低ME、提高RE和PE，因此减少上样量可以避免固相萃取柱过载造成的净化不彻底；但上样量较低时的提取效率有所降低，这可能是由于固相萃取过程本身造成了目标化合物的损失，因此考虑进一步优化固相萃取条件。

2.1.4 固相萃取条件的优化

C18固相萃取柱属于非极性柱，主要用于除去样品中的脂肪等非极性成分[32]，对甲基睾丸酮的吸附作用很小。对固相萃取柱进行活化可以使吸附剂保持湿润而具有吸附能力，同时可以除去填料中可能存在的杂质。固相萃取柱的活化要充分，且不同分离模式固相萃取柱的活化溶剂也不同，C18固相萃取柱通常使用水溶性有机溶剂进行活化，例如先用甲醇淋洗，再用水或缓冲溶液淋洗[33]。本研究分别采用以下3 种方式对固相萃取柱进行活化：方法1：不经活化直接上样，收集净化液，并用3 mL甲醇洗脱；方法2：甲醇活化后上样，收集净化液，并用3 mL甲醇洗脱；方法3：甲醇、水依次活化后上样，收集净化液，并用3 mL甲醇洗脱。

由表6可知，由于方法3最后加入的活化试剂是水，而样品洗脱液主要是有机溶剂甲醇，这可能会影响C18固相萃取柱对提取液中非极性杂质的吸附，因此方法2的ME最小、RE和PE最高，即C18固相萃取柱经甲醇活化后直接上样，收集净化液的效果最佳。

2.2 实验方法验证

2.2.1 甲基睾丸酮标准溶液的提取离子色谱图及线性关系

质量浓度为50 ng/mL的甲基睾丸酮标准溶液的提取离子色谱图如图1所示。以甲基睾丸酮标准溶液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，所得线性方程为y=1 782.882x-1 525.374，R2≥0.998，在1～50 ng/mL

范围内甲基睾丸酮的线性关系良好。

2.2.2 方法检出限和定量限

对空白样品进行20 次平行测定，根据GB/T 27404—2008

《实验室质量控制规范食品理化检测》[34]中规定的CL=3Sb/b（其中CL为方法定量限，Sb为空白值标准偏差，b为方法校准曲线斜率），得出甲基睾丸酮的定量限为1.0 μg/kg，检出限为0.3 μg/kg。

2.2.3 方法回收率和精密度

动物源性食品空白样品及空白样品中加入40.0 μg/kg甲基睾丸酮标准物质后的提取离子色谱图如图2所示。

由表7可知，将加入量分别为1.0、2.0、10.0、40.0 μg/kg的甲基睾丸酮标准物质添加到空白动物源性食品样品中的回收率在70.60%～112.41%之间，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）≤9.26%。GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[34]规定被测组分含量小于100 μg/kg时，回收率应在60%～120%之间、R2≥0.99；被测组分含量为1.0、10.0、100.0 μg/kg时，RSD应分别满足RSD≤30%、RSD≤21%、RSD≤15%，因此本研究所建立方法的相关系数、回收率和精密度均符合要求。

表 7 加标样品中甲基睾丸酮的回收率和精密度（n=6）

2.3 实际样品检测

随机选取108 份进口肉类样品（冻猪背皮30 份、冻猪背膘30 份、冻猪去皮去骨后腿肉48 份），分别采用本研究建立的方法（方法1）和农业部1031号公告-1-2008《动物源性食品中11 种激素残留检测液相色谱-串联质谱法》[35]中的方法（方法2）进行检测，结果表明，108 份进口肉类样品中均未检出甲基睾丸酮。

随机选取以上3 种肉类的阴性样品各2 份，分别以1.0、2.0 μg/kg的加标量加入甲基睾丸酮标准溶液，再分别采用方法1和方法2进行检测。由表8可知，2 种方法的测定结果基本一致，回收率为69.0%～95.0%，且方法1采用外标法，与方法2相比降低了成本，因此本研究建立的检测方法可行。

3 结论

本研究基于降低基质效应、提高回收率及方法效率，探索并建立了一种利用UPLC-MS/MS法测定动物源性食品中甲基睾丸酮残留量的方法。该方法测定甲基睾丸酮的检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg，回收率、精密度和准确度均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》中的规定；同时，通过与农业部1031号公告-1-2008中的方法进行对比，证实本研究建立的方法检测准确性较高。本方法操作簡便、成本较低、提取溶剂用量小，减少了污染及对实验操作人员的危害，适用于批量动物源性食品中甲基睾丸酮的检测。

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