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标题

生物保鲜剂延长冷鲜牛肉货架期的效果

范文

李儒仁沈瑞荣良燕林世文张鹏叶盛德励建荣

摘要：为延长冷鲜牛肉的货架期，保证其贮藏期间的食用品质及安全性，采用单因素试验与正交试验筛选一组复配生物保鲜剂（乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸），并研究其对冷鲜牛肉的保鲜效果。结果表明：复配生物保鲜剂中3 种保鲜剂的最佳配比为乳酸链球菌素2.5 g/L、纳他霉素1.5 g/L、ε-聚赖氨酸3.0 g/L；冷鲜牛肉在（4±1） ℃条件下贮藏8 d后，其挥发性盐基氮值为19.84 mgN/100 g，属于二级鲜肉；菌落总数较对照组降低2 个数量级，表明复配生物保鲜剂能够有效抑制腐败菌的增长；贮藏后期，处理组冷鲜牛肉的汁液流失率较对照组减少1.73%。复配生物保鲜剂可以将冷鲜牛肉的货架期有效延长4 d。

关键词：冷鲜牛肉；生物保鲜剂；复配；保鲜；货架期

Effect of Biological Preservatives in Extending the Shelf-life of Chilled Beef

LI Ruren1， SHEN Rui1， RONG Liangyan1， LIN Shiwen1， ZHANG Peng2， YE Shengde3， LI Jianrong1，*

（1.Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province， National and Local Joint Engineering Research Center of Storage， Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products， College of Food Science and Technology， Bohai University， Jinzhou 121013， China； 2.Tianjin Key Laboratory of Postharvest Physiology and Storage of Agricultural Products，

National Engineering and Technology Research Center for Preservation of Agricultural Products （Tianjin）， Tianjin 300384， China；

3.Zhejiang Silver-Elephant Bioengineering Co. Ltd.， Taizhou 317200， China）

Abstract： Various combinations of three biological preservatives （nisin， natamycin and ε-polylysine） were screened using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods for their efficacy in extending the shelf-life of chilled beef and ensuring its quality and safety during storage. The effect of the selected combination on quality changes of chilled beef was investigated. The results showed that the optimal combination was found to be 2.5 g/L nisin， 1.5 g/L natamycin and 3.0 g/L

ε-polylysine. The total volatile base nitrogen （TVB-N） value of chilled beef treated with this combination after being stored for 8 days at （4 ± 1） ℃ was 19.84 mgN/100 g， reaching the second-grade level of fresh meat. In addition， the total viable count of chilled beef in the treatment group was reduced by 2 orders of magnitude compared with the control group， demonstrating that the combination of preservatives inhibited the growth of spoilage bacteria effectively. At the end of storage life， the drip loss of the treatment group was reduced 1.73% compared with the control group. This treatment extended the shelf-life of chilled beef by 4 days.

Keywords： chilled beef； biological preservative； combination； preservation； shelf-life

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005

中圖分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2018）01-0030-06

引文格式：

李儒仁，沈瑞，荣良燕，等. 生物保鲜剂延长冷鲜牛肉货架期的效果[J]. 肉类研究， 2018， 32（1）： 30-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005. http：//www.rlyj.pub

LI Ruren， SHEN Rui， RONG Liangyan， et al. Effect of biological preservatives in extending the shelf-life of chilled beef[J]. Meat Research， 2018， 32（1）： 30-35. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201801005. http：//www.rlyj.pub

牛肉作为一种重要的肉类原料，其市场需求量日益增加。冷鲜肉经历排酸后熟过程后，蛋白质发生降解，嫩度明显提高，有利于人体消化吸收[1]，受到消费者的青睐[2]。然而，冷鲜牛肉贮藏过程中的环境条件控制不当容易造成致腐微生物的大量增殖，影响产品货架期，4 ℃冷藏牛肉的货架期仅为3～5 d[3]，且随着贮藏时间的延长，牛肉的食用品质及安全性逐渐降低[4]。因此，如何有效提高冷鲜牛肉的货架期已成为目前亟需解决的问题。

适宜的保鲜方法可以有效延长冷鲜牛肉的货架期。冷链、气调包装、超临界CO2和冷源等离子体等技术可以获得较好的抑菌效果，但由于成本较高、技术不成熟等问题[5-6]，目前尚未在全国范围内得到广泛应用，而化学合成保鲜剂因其便捷性和低成本的优势，被广泛应用于肉类防腐保鲜。研究表明，乳酸、乙酸、柠檬酸、食盐等复配处理冷鲜雪花牛肉可使其货架期延长7 d[7]。然而，消费者对部分化学保鲜剂的安全性存在顾虑[8]，如亚硝酸盐等在加工过程中容易转变为致癌物二甲基亚硝铵[8]。

相比于化学合成保鲜剂，植物源防腐剂无毒无害、天然高效，应用前景广阔[9]。例如，香辛料提取物及精油等通过涂膜保鲜可以有效延长牛肉的货架期[10]，但受限于成本问题，未被商业化利用。相比于植物源防腐剂，细菌素等微生物源生物保鲜剂更具优势[11]，其抑菌成分主要来源于生物体本身的分泌或代谢产物，抑菌效果明显，被广泛应用于肉类保鲜，通过复配其他保鲜剂或结合物理保鲜方法可以有效提高其保鲜效果[12]。ε-聚赖氨酸与茶多酚、壳聚糖等结合使用可以有效延长冷却猪肉的货架期[13]；乳酸链球菌素与乳酸联合使用，结合气调包装对猪肉中的单增李斯特菌属具有优良的抑菌效果[14]；纳他霉素与脱氢乙酸、壳聚糖、乳酸链球菌素等复配使用可以有效抑制酱卤肉制品中的致腐微生物[15]。乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸单独使用的效果欠佳，它们分别与其他类型的保鲜剂复配使用时效果相对较好。乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸分别与化学保鲜剂及植物源防腐剂复配使用较为常见，但部分化学保鲜剂由于本身不确定的安全隐患逐渐退出历史舞台。生物保鲜剂在成本及安全性方面有明显优势，更容易受到企业的青睐[16]。上述3 种保鲜剂的抑菌原理类似，均可以通过破坏腐败菌的细胞膜结构导致其死亡。然而，三者的复配效果如何目前尚不清楚。

本研究通过复配3 种生物保鲜剂（乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸），以挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）值、菌落总数、pH值和汁液流失率等作为评价指标，探究其对冷鲜牛肉货架期的延长效果，为生物保鲜剂的进一步利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳酸链球菌素、纳他霉素、ε-聚赖氨酸（均为食

品级）浙江新银象生物工程有限公司；牛肉锦州大润发超市；平板计数培养基、轻质氧化镁、氯化钠。

1.2 仪器与设备

BCD-215KALM冰箱青岛海尔股份有限公司；

LDZX-50FB灭菌锅上海申安电器有限公司；JYL-C012绞肉机九阳股份有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；FJ300-SH数显高速分散均质机上海标本模型厂；LRH-150生化恒温培养箱上海一恒医疗器械有限公司；Kjeltec 8400全自动凯氏定氮仪丹麦Foss公司；FE20 pH计美国Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

牛肉购买后置于冰盒中，立即送往实验室处理。刀和砧板用75%酒精擦拭消毒后置于超净工作台，紫外灯照射20 min；无菌条件下分割牛肉，按实验所需分为每份40 g、60 g 2 种规格，无菌水冲淋；将牛肉浸泡于预配保鲜剂中30 min，以无菌水处理作为对照；用无菌滤纸迅速吸干牛肉表面残留的水分，用灭菌蒸煮袋包装封口后置于4 ℃冰箱中贮藏，每隔4 d取样测试。

1.3.2 实验设计

1.3.2.1 單因素试验设计

以牛肉贮藏第8天的TVB-N值为评价指标，选取乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸的质量浓度3 个因素设计单因素试验。各因素水平如表1所示。

1.3.2.2 正交试验设计

根据单因素试验结果，以牛肉贮藏第8天的TVB-N值为评价指标，以乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸的质量浓度为试验因子，采用L9（33）正交试验优选出最佳的保鲜剂组合。

1.3.3 菌落总数测定

参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[17]。

菌落总数参考标准：一级鲜度为小于4.0 （lg（CFU/g）），二级鲜度为4.0～6.0 （lg（CFU/g）），变质肉大于6.0 （lg（CFU/g））[18]。

1.3.4 TVB-N值测定

参照GB 5009.228—2016《食品安全國家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[19]。取10 g绞碎肉样于蒸馏管，加入1 g氧化镁粉末，全自动凯氏定氮仪测定。

TVB-N值参考标准：一级鲜度为小于15 mgN/100 g，二级鲜度为15～20 mgN/100 g，变质肉大于20 mgN/100 g[20]。

1.3.5 pH值测定

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》[21]。取5 g绞碎肉样于烧杯中，加入45 mL蒸馏水，均质，过滤，取滤液用pH计测定。

参考标准：一级鲜度的pH值为5.8～6.2，二级鲜度为6.3～6.6，pH值大于6.7则为变质肉[22]。

1.3.6 汁液流失率测定

参照Davis等[23]的方法，并稍作改进。汁液流失率按照下式计算。

式中：m1为肉样沥干水分后的质量/g；m2为用滤纸将肉样表面水分吸干后的质量/g。

1.4 数据处理

每个指标均重复测定3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析LSD法与双变量相关性分析法分析数据间的相关性与显著性

（P<0.05）；采用Origin 2017软件绘图。

2 结果与分析

2.1 冷鲜牛肉初始TVB-N值

TVB-N是由于致腐微生物以及蛋白酶对肉样中蛋白质的降解而产生的具有挥发性的含氮类物质[24]，TVB-N值可用于评价肉品新鲜度[25]。由表2可知，各肉样初始TVB-N值均在一级鲜度范围内（<15 mgN/100 g）[20]，符合实验所需肉样要求。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 乳酸链球菌素对冷鲜牛肉的保鲜效果

由表3可知，贮藏8 d后，各处理组冷鲜牛肉的TVB-N值均显著增加（P<0.05）。贮藏8 d后，对照组冷鲜牛肉的TVB-N值为（23.67±0.98） mgN/100 g，属于变质肉，显著高于各处理组（P<0.05）。2.0 g/L乳酸链球菌素处理组冷鲜牛肉的保鲜效果最优，TVB-N值为（15.45±0.65） mgN/100 g，显著低于其他处理组

（P<0.05）。因此，正交试验中选择乳酸链球菌素的添加水平为1.5、2.0、2.5 g/L。

2.2.2 纳他霉素对冷鲜牛肉的保鲜效果

由表4可知，贮藏8 d后，各处理组冷鲜牛肉的TVB-N值存在差异。纳他霉素质量浓度为1.5 g/L时的保鲜效果较好，冷鲜牛肉的TVB-N值为（9.37±0.34） mgN/100 g，保鲜效果显著优于1.0、2.0 g/L纳他霉素处理组（P<0.05）。当纳他霉素质量浓度增加至2.0 g/L时，保鲜效果呈下降趋势，且纳他霉素质量浓度为1.0、2.0 g/L时的保鲜效果无显著差异。因此，正交试验中选择纳他霉素的添加水平为1.0、1.5、2.0 g/L。

2.2.3 ε-聚赖氨酸对冷鲜牛肉的保鲜效果

由表5可知，贮藏8 d后，不同质量浓度ε-聚赖氨酸处理组冷鲜牛肉的TVB-N值存在差异。ε-聚赖氨酸质量浓度较低时（1.0 g/L），处理组与对照组牛肉的TVB-N值无显著差异（P>0.05）；随着ε-聚赖氨酸质量浓度的增加，牛肉的TVB-N值显著降低（P<0.05）；ε-聚赖氨酸的质量浓度增至5.0 g/L时，其对冷鲜牛肉的保鲜效果已达阈值。其中，2.0 g/L ε-聚赖氨酸处理组牛肉的TVB-N值为（14.58±0.01） mgN/100 g（一级鲜度），显著低于其他处理组。因此，正交试验中选择ε-聚赖氨酸的添加水平为1.0、2.0、3.0 g/L。

2.3 正交试验结果

由表6～7和图1可知，贮藏期间各组冷鲜牛肉的TVB-N值均增加。贮藏第4天时，对照组牛肉的TVB-N值为14.08 mgN/100 g，接近一级鲜度的临界值15 mgN/100 g，而处理组冷鲜牛肉的TVB-N值仍维持在一级鲜度内，且与第0天相比无显著差异（P>0.05）。贮藏8 d后，对照组牛肉的TVB-N值为21.36 mgN/100 g，大于二级鲜度临界值20 mgN/100 g，此时，除2号处理组外，各处理组牛肉的TVB-N值均维持在一级鲜度临界值内，保鲜效果良好。贮藏第12天时，各处理组牛肉的TVB-N值均在二级鲜度范围内，说明复配生物保鲜剂可以有效抑制冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N值的增加，有效延长其货架期。冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N值的影响因素主次关系为乳酸链球菌素>ε-聚赖氨酸>纳他霉素，说明乳酸链球菌素在抑制冷鲜牛肉腐败变质过程中发挥关键作用。本研究筛选出的最优保鲜剂组合为乳酸链球菌素2.5 g/L、纳他霉素1.5 g/L、ε-聚赖氨酸3.0 g/L。

2.4 验证实验结果

对经过正交试验优选出的保鲜剂组合进行验证实验，从冷鲜牛肉贮藏期间的菌落总数、TVB-N值、pH值和汁液流失率4 个方面进行综合评价，最终确定复合保鲜剂对冷鲜牛肉的保鲜效果。

2.4.1 复配保鲜剂对冷鲜牛肉贮藏期间菌落总数的影响

致腐微生物的大量繁殖影响冷鲜牛肉贮藏过程中的品质[26]，菌落总数可以直观反映肉品新鲜度。由图2可知，随着贮藏时间的延长，冷鲜牛肉的菌落总数显著增加，且处理组牛肉的菌落总数始终低于对照组，表明复配保鲜剂的抑菌效果显著。贮藏4 d时，对照组牛肉的菌落总数为6.37 （lg（CFU/g）），属于变质肉，此时处理组牛肉的菌落总数为5.35 （lg（CFU/g）），属于二级鲜肉。贮藏8 d时，与对照组相比，处理组牛肉的菌落总数下降2 个数量级，复配保鲜剂对冷鲜牛肉的保鲜效果优于茶多酚[27]。

2.4.2 复配保鲜剂对冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N值的影響

由图3可知，由于细菌和酶对蛋白质的分解作用，贮藏期间冷鲜牛肉的TVB-N值呈增加趋势，且处理组的TVB-N值始终低于对照组，说明复配保鲜剂能有效抑制冷鲜牛肉的TVB-N值增长，这与LI Yingqiu等[28]的研究结果类似。贮藏4 d后，对照组牛肉的TVB-N值达21.44 mgN/100 g，超出二级鲜肉的临界值20 mgN/100 g，属于变质肉，此时处理组牛肉的TVB-N值为12.30 mgN/100 g，属于一级鲜肉。当贮藏时间达到8 d时，处理组牛肉的TVB-N值（19.84 mgN/100 g）仍在二级鲜肉的临界值（<20 mgN/100 g）内。

2.4.3 复配保鲜剂对冷鲜牛肉贮藏期间pH值的影响

由图3可知，贮藏期间对照组冷鲜牛肉的pH值呈增加趋势，这和崔英丽等[29]的研究结果一致。在贮藏过程中，由于蛋白质被分解为胺类及含氮化合物，导致样品pH值上升[30]。当贮藏时间达到12 d时，对照组牛肉的pH值为6.79，属于变质肉；处理组牛肉的pH值在贮藏期间增加缓慢且低于对照组，贮藏12 d时的pH值（6.58）仍维持在二级鲜肉pH值范围（<6.7）内。

2.4.4 复配保鲜剂对冷鲜牛肉贮藏期间汁液流失率的影响

由图4可知，随着贮藏时间的延长，冷鲜牛肉的汁液流失率均呈增加趋势，贮藏后期，处理组牛肉的汁液流失率低于对照组。当贮藏至12 d时，处理组牛肉的汁液流失率为7.39%，而对照组为9.12%，且差异显著

（P<0.05）。可见，复配生物源保鲜剂可以显著减少冷鲜牛肉贮藏期间的汁液流失。

3 讨论

复配生物保鲜剂可以将冷鲜牛肉的货架期有效延长4 d，且3 种保鲜剂单一使用均有一定的抑菌效果，提高了冷鲜牛肉的保鲜效果。

乳酸链球菌素可以使冷鲜牛肉的TVB-N值显著降低（P<0.05）。作为多肽抗菌素，乳酸链球菌素对单增李斯特菌属和部分革兰氏阳性（G+）菌（如沙雷氏菌、金黄色葡萄球菌）等致腐菌具有良好的抑菌作用[31-32]。乳酸链球菌素通过降低腐败菌细胞膜磷脂数量，抑制细胞膜孔道的形成，阻碍膜内外的信息与能量传递，破坏细胞膜结构，进而抑制腐败菌生长[33]。但由于革兰氏阴性（G-）菌细胞膜上存在疏水层外膜，通过物理方式阻隔了乳酸链球菌素与细胞膜的接触，从而导致乳酸链球菌素对其无抑制作用[31]，因此，单一使用乳酸链球菌素的效果有限。

ε-聚赖氨酸对冷鲜牛肉的TVB-N值的增长同样具有抑制作用。ε-聚赖氨酸具有广谱抑菌性，对酵母菌、霉菌、G+菌及G-菌具有一定的抑制作用[34]。带有正电荷的ε-聚赖氨酸能与致腐菌细胞膜表面的负电荷结合，破坏细胞膜的结构，造成细胞质流失，进而导致腐败菌死亡[35]。

研究表明，ε-聚赖氨酸可能影响微生物的基因表达，导致关键蛋白合成受阻，抑制腐败菌的活性[36]。

纳他霉素的抑菌范围有限，处理组与对照组冷鲜牛肉的TVB-N值差异较小。纳他霉素含有的疏水基团与真菌（如霉菌、酵母菌）细胞膜上的甾醇结合，导致细胞膜溶解，从而抑制致腐菌生长，但对于细胞膜上无甾醇结构的腐败菌无明显抑制作用[37-38]。

与单一保鲜剂相较而言，复配生物保鲜剂对冷鲜牛肉TVB-N值的抑制作用更加显著（P<0.05），其原因可能是3 种保鲜剂复配使用扩大了其抑菌范围，提高了抑菌能力。冷鲜牛肉贮藏初期的优势腐败菌主要为G-菌（假单胞杆菌、嗜冷杆菌等）；贮藏后期的优势腐败菌为G+菌（环丝菌属等）[39]。贮藏期间的腐败菌范围较大，单一保鲜剂的抑菌范围相对较窄，因此通过复配能够提高保鲜剂对冷鲜牛肉的保鲜效果。乳酸链球菌素、纳他霉素和ε-聚赖氨酸作为微生物源防腐剂，其抑菌机理相似，对腐败菌细胞膜均有一定的破坏作用，3 种保鲜剂复配使用时，其间可能存在协同作用，对腐败菌细胞膜的破坏作用增强，从而有效抑制腐败菌的生长，改善其对冷鲜牛肉的保鲜效果。

冷鲜牛肉贮藏期间的各指标之间存在一定相关性。菌落总数与TVB-N值呈显著正相关（r=0.987、

P<0.05），与pH值呈正相关（r=0.923）；pH值与TVB-N值呈正相关（r=0.972）。TVB-N是微生物分解蛋白质产生的挥发性物质，贮藏过程中致腐菌的增长加速了冷鲜牛肉中蛋白质的分解，导致TVB-N值增加，而这类碱性挥发性物质的不断积累导致冷鲜牛肉pH值上升。此外，汁液流失率与菌落总数之间也存在相关性（r=0.926）。冷藏过程中冷鲜牛肉的汁液流失率较大，不利于冷鲜牛肉的保鲜。研究表明，冷鲜牛肉的水分活度大于0.95时，有利于绝大多数微生物生长，如梭状芽孢杆菌、假单胞菌等[40]。并且，流失的汁液中含有大量的水溶性营养物质，这为微生物提供了优良的培养基，加速了冷鲜牛肉的腐败过程。因此，有必要在后续研究中探索降低汁液流失率的最佳方案。

4 结论

复配生物保鲜剂可以有效延长冷鲜牛肉保鲜期至8 d，3 种保鲜剂的最佳配比为乳酸链球菌素2.5 g/L、纳他霉素1.5 g/L、ε-聚赖氨酸3.0 g/L。复配生物保鲜剂有效控制了致腐微生物的生长繁殖，贮藏后期，处理组冷鲜牛肉的菌落总数较对照组降低2 个数量级，且贮藏期间处理组冷鲜牛肉的TVB-N值始终显著低于对照组

（P<0.05）。复配生物保鲜剂维持了肉样pH值的稳定，提高了肉样的持水力，有效保障了冷鲜牛肉的食用品质和安全性，这对于进一步推广使用生物保鲜剂具有一定价值。

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