| 标题 | 斑马鱼胚胎用于汽车尾气颗粒物毒性监测的可行性 |
| 范文 | 超克+杨景峰+李佳怡 摘要：概述了汽车尾气的污染状况及危害、汽车尾气颗粒物的检测、斑马鱼的优点，探讨了斑马鱼用于汽车尾气颗粒物毒性检测的可行性。 关键词：汽车尾气颗粒物；生物监测；斑马鱼胚胎；毒性 中图分类号：X830.2 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）02-0074-05 DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.02.014 现今，随着科学技术的发展以及经济水平的提高，汽车已经成为人类不可缺少的交通运输工具。它给人们的生活和工作带来了便利的同时，也带来了极大的污染：汽车尾气危害人体健康，破坏城市建筑物及景观，对人类的生存环境造成极大影响[1]。伴随汽车工业的快速发展、汽车产量和保有量不断增加，汽车尾气大量排放已逐渐成为大气的主要污染来源[2-3]。 1 汽车尾气的危害及污染状况 汽车尾气排放对环境的污染主要集中表现在城市的空气污染，尾气中含有上百种的化合物，排放入空气后容易形成酸雨、光化学烟雾、雾霾等现象[4]。汽车尾气中所包含的物质主要有一氧化碳（CO）、氮氧化物（NOx）、碳氢化合物（HC）和细微颗粒物等，这些污染物对人体健康具有潜在的、长久危害，对生态环境同样造成直接污染和破坏[5]。据统计，每千量汽车每天排出一氧化碳约3000kg，碳氢化合物质200-400kg，氮氧化合物50-150kg。一氧化碳与血红蛋白有高度的亲和力，比氧气要大210倍以上，当空气中一氧化碳浓度升高时，血红蛋白与一氧化碳相结合，丧失运输氧的能力，可危及人和动物生命。碳氢化合物中包含多种有机物成分，部分有机成分被证明是非常强的致癌物质，如苯、苯并芘等多环芳烃类物质。尾气中的氮氧化合物含量相对较少，但毒性却非常的大，达到一定浓度就会对人的呼吸系统和免疫功能造成严重危害。此外，汽车尾气中的含铅化合物很多，可随呼吸进入血液，并长期蓄积在体内，引起贫血、脑损伤等症状，还会影响儿童正常成长和智力发育低下，甚至出现严重痴呆症状。铅还能经由母体血液进入胎盘，危害胎儿健康。2000年开始，我国在全国范围内推广了无铅汽油，解决了汽车尾气中铅污染的问题，但事实上，无铅汽油仍然存在不少环境污染问题[6]。近年来，随着雾霾等大气污染问题的日益突出，也使得大量细颗粒物（fine particulate matter，PM2.5）走进了人们的视野，细颗粒物对大气的污染形势十分严峻。 2 汽车尾气颗粒物 汽车颗粒物污染是对人体健康危害最大的大敌。颗粒物被定义为可悬浮于空气中的固体和液体微粒，根据粒径大小可分为总悬浮颗粒物（粒径≤100μm）、粗颗粒物（粒径≤10μm，即PM10）和细颗粒物（粒径≤2.5μm，即PM2.5，也成为可入肺颗粒物）、超细微粒（粒径≤100 nm）等。目前国内大多数研究集中在细颗粒物对人体各器官的损害。汽车尾气排出的颗粒物表面较粗糙且呈多空隙状态，具有较强的吸附能力[7]。汽油燃烧过程中产生的大量有机物、未燃油和挥发性有机物等都会吸附在其上。分析结果显示，颗粒物吸附有多种有机物，其中主要包括酸、酯、烷烃、多环芳烃类（PAHs）如芘、蒽等、杂环化合物（苯并噻唑）、含氧化合物等。无铅汽油车尾气排出颗粒物，颗粒物吸附的有机物所占的比例较高， 而且由于无铅汽油中芳烃、烯烃的含量高，颗粒物也含有多种的芳烃化合物 [8]。颗粒物对人体的毒性作用取决于颗粒物的来源、浓度、粒径、化学组成（过渡金属、可溶性组分、有机成分、生物成分）、酸性、吸湿性、可溶性，以及与其他污染物的协同作用[9]。 在尾气颗粒物排放上，美国是全球最早制订排放标准的国家之一，也是汽车排放法规最严的国家，其中联邦标准（EPA2010）最为严格，比如其规定的重卡柴油机氮氧化物和颗粒物，每制动马力1小时的排放上限分别为 0.2 g 和 0.01 g，几乎相当于零排放。近些年，欧洲标准的限值也是越来越严。日本也在很早之前就对细颗粒物的来源和危害有过很多的研究，得出汽车排放的颗粒物是城市中PM2.5的主要来源，而且粒径相对较小的细颗粒物还具有致癌作用[10]。而我国自从细颗粒物指标加入新修订的 GB3095-2012《环境空气质量标准》以来，机动车细颗粒物排放才得到重视，尾气颗粒物毒性的生物监测也成为一个研究热点。由于采样和检测设备、技术和方法的缺乏，尾气颗粒物的生成机理、检测方法、毒性效应等还需要进一步地研究。 3 汽車尾气颗粒物生物监测现状 以下内容是有关不同种类的生物学监测介绍。 3.1 细胞系及酵母等监测与研究 3.1.1 人癌细胞 张遵真等[11]为研究汽车尾气的毒性作用机制，以人肺腺癌A549细胞为研究对象，采用MMT试验检测汽车尾气颗粒物对细胞的毒性作用，结果显示出明显的细胞毒性，且随浓度的增加，细胞存活率也下降。 3.1.2 重组基因酵母 王娟等[12]的实验中，采用环境雌激素基因重组酵母测评系统，测定了汽车尾气的雌激素活性。结果表明汽车尾气在最高剂量时吸光度值（A600）远远低于其他各剂量组，说明汽车尾气超过一定浓度范围会对酵母细胞产生毒性作用，导致酵母细胞死亡。同时，汽车尾气在个别剂量时检出雌激素活性，说明汽车尾气具有微弱雌激素样作用。此外，吴文忠等[13]用重组基因酵母检测了污泥、土壤中的类雌激素污染物，发现样品馏分中多环芳烃（PAHs）的含量与雌激素的活性正相关。通过研究尾气颗粒物的组成，结合一些研究结果和参考文献，有理由推测汽车尾气中的雌激素样作用可能与尾气颗粒物中的多环芳烃类（PAHs）等物质有关。 3.2 昆虫系统监测与研究 这是一个有趣的研究领域，高慧璟等[14]研究了道路交通污染对昆虫的影响。其中提到，汽车尾气中的细颗粒物飘落到公路干线两侧的植物表面，与植物组织结合后很难分解，通过食物链转移到植食性昆虫及其天敌体内，并造成严重威胁。根据昆虫对污染物的反应类型进行区系分类，开展昆虫系统调查，同时利用昆虫对交通污染物的特异性反应，进行环境监测指示生物研究[15]。 3.3 哺乳动物监测与研究 哺乳动物的监测与研究主要是围绕大鼠及小鼠用于汽车尾气颗粒物毒性监测展开的。 3.3.1 呼吸系统损害 在早年，彭宝成等[16]就曾采用大鼠气管内注入尾气颗粒物的形式观察生物效应。得出结论，汽车尾气颗粒物能引起肺组织及细胞染色体损伤。近些年，颗粒物致呼吸系统的损害依然是比较常见的研究方向。肖纯凌等[17]，通过制备动物模型，即SPF级Wistar大鼠气管注入PM2.5混悬液及其他对照样本，观测暴露不同时期大鼠气管和肺泡的超微结构变化。结果大鼠气管扫描电镜观察可见，随着染毒剂量的增高，气管上皮纤毛粘连、紊乱； PM2.5对大鼠肺组织的损害比对气管上皮的损害严重得多，可使肺纤维增生，肺泡腔变小，甚至使肺泡上皮细胞脱落溶解。与大鼠一样，作为哺乳动物首先考虑尾气对其肺部损伤的作用。唐思文等[21]选择SPF级雄性昆明小鼠（Kunming mice，KM小鼠）作为实验动物。随机分组，采用自制汽车尾气染毒柜进行短时、多次、连续染毒。通过肺组织HE染色、免疫组化法、Western印迹法等实验方法检测发现汽车尾气暴露后，小鼠肺组织出现明显病理损伤，其作用与多个炎症因子表达增高和氧化损伤有关。 3.3.2 生殖功能损害 严超等[18]研究，建立Sprague Dawley（SD）大鼠汽车来源PM2.5长期暴露模型，研究PM2.5长期暴露对SD大鼠生殖功能的损伤及其机制。将足够数量SD雄性大鼠样本 随机分配成 3 组： 生理盐水对照组，低剂量组，高剂量组。连续暴露，统计雌鼠受孕率，剩余实验鼠取材，进行精子计数和畸形率测定、睾丸组织病理学检测以及睾丸组织蛋白表达检测。通过实验得出，PM2.5长期暴露损伤血睾屏障的完整性，进而破坏生精微环境的稳定，生精细胞发育异常，精子生成数量减少和质量降低，并最终导致生殖功能损伤。 3.3.3 胚胎毒性及遗传毒性 比较特别的研究，王海青等[19]使用妊娠期Wistar大鼠，通过动式染毒装置进行吸入染毒，观察汽车尾气对妊娠结局及胎鼠的影响，得出汽车尾气具有胚胎毒性和遗传毒性的结论。指出尾气中的多环芳烃（PAHs）可以通过胎盘屏障，造成胎儿生长发育受限。同样，根据叶雯婧等[20]等报道，通过对汽车尾气颗粒物进行采样，制备提取液。向孕鼠妊娠起经腹腔注射，按二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）对照组、低浓度组合高浓度组进行研究。结果高剂量组非存活胎鼠发生率和活胎鼠宫内发育迟缓发生率均高于对照组；高低剂量组均出现外观畸形的活胎鼠，对照组的活胎鼠外观正常。通过HE染色观察到不同程度的组织病理损伤。得出汽车尾气颗粒物可造成胎盘组织病理损伤，增加了宫内发育迟缓和外观畸形的发生率的结论。 3.3.4 其他器官或者多器官的损害 与上述同样的暴露方法及实验手段，还可以研究尾气颗粒物的多器官毒性。结果显示，与正常组相比，PM2.5暴露组的SD大鼠体重明显降低，且肺部外观改变明显，肺脏及心脏组织结 构受损，出现心肌水肿，炎症反应明显，肝脏、脾脏及肾脏亦有炎症表现[22]。在小鼠，张志红等[23]利用汽车尾气颗粒物有机提取物进行腹腔注射染毒。测定小鼠外周血白细胞分类、体重增长和脏器重量、抗体形成细胞实验及腹腔巨噬细胞吞噬功能实验4个指标。结果表明，尾气颗粒物对小鼠免疫功能有抑制作用，并且是多方面的。 4 斑马鱼在科研中的优势 斑马鱼（Danio rerio）是一种常见的小型热带淡水鱼。因为体侧有类似斑马一样的条纹而得名。斑马鱼体型纤细，成鱼体长约4cm，成梭形或纺锤形。它的世代时间短，3～4个月即可达到性成熟。斑马鱼常年产卵，成熟雌鱼每隔几天可产几百枚卵。卵子体外受精、发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。斑马鱼对水质要求不高，发育温度为25～31℃。目前斑马鱼己逐渐成为最受关注的脊椎动物发育生物学模式之一，在环境毒理学、病理毒理学等方面显示出了很大的优势[24]。 概括来说，斑马鱼作为模式生物有以下优点：（1）成本低：由于斑马鱼体型小，所需养殖空间少，养殖成本低；能大规模养殖繁育，便于获得大量样本；染毒剂量少，节约实验成本；（2）易观察：斑马鱼胚胎透明，可以清楚地观察到各个阶段的发育情况；（3）可利用信息丰富：斑马鱼由于基因信息全面且已有多种转基因鱼模型，作为一种国际标准的动物模型而普遍应用于医学、基因组学及生态毒理学的研究中；（4）斑马鱼胚胎敏感度高，这对环境毒理评价具有重要意义；（5）研究方法多：如整体原位杂交技术、整体免疫组化技术、荧光技术等；（6）具有遗传毒性：斑马鱼生长周期短，有利于次代的检测与观察。 在我国，斑马鱼被广泛用于胚胎发育学研究领域，一般常用动物模型如小鼠属于胎盘动物，胚胎操作时不能离开母体，实验分析时就需要大量推论，用时超过20天，需要大量的资金和人力。而斑马鱼的胚胎体外发育且发育非常迅速，各发育阶段有其明显的特征，易于准确地在各不同阶段进行处理[25-26]。 5 斑马鱼胚胎作为尾气颗粒物毒性监测模 型的可行性 颗粒物对人体的危害与其来源以及复杂的理化性质（如表面形态特征、吸附组分等）有着很大的关系，它对人体可能产生诸多危害，毒性机制也不唯一，因此对颗粒物的毒性需要进行高通量评价[27-28]。而斑马鱼胚胎的经济、快速、敏感，可大面积高通量初期筛选与检测，突出了其显著优点。 给斑马鱼胚胎染毒所用的汽车尾气颗粒物，使用大中流量大气采样装置和称重过的玻璃纤维滤膜进行采样，也可采用直接刮取排气管上积碳的方法。采样后的滤膜进行再次称重，记錄。浸泡于酒精或其他溶剂经超声波震荡萃取，过滤后提纯，用二甲基亚砜（DMSO）溶剂定容，提取液4℃保存[29]。实验动物斑马鱼胚胎，选用受精后2h的斑马鱼进行梯度染毒，因为斑马鱼胚胎及幼鱼呈透明状，因此它在形态学方面极易观察。在光学显微镜下可以很直观的看到他的发育状况是否正常。可以通过软骨染色观察颗粒物提取液对斑马鱼胚胎软骨发育的影响。也可以深入的做病理组织学及其酶类变化方面的的检测. 还可以通过切片，以及HE染色来观察尾气颗粒物对斑马鱼胚胎肝脏等器官的组织学变化，通过二恶英类物质标志物质细胞色素P450 （CYP1A）的诱导期强度（如CYP1A抗体染色或者定量PCR）检测二恶英类物质的污染程度。 综上所述，表明斑马鱼胚胎作为汽车尾气颗粒物毒性生物监测测模型具有实际可行性。尤其是污染物的高通量检测，为尾气净化技术、污染检测技术及污染物过滤技术提供高通量检测。 参考文献 [1]耿永生.汽车尾气污染及其控制技术[J].环境科学导刊，2010，29（6）：62-69. 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