| 标题 | 精液混合斑分离法医学研究进展 |
| 范文 | 王婧茹 黄存金 随着生物技术不断的发展进步，法医DNA分析技术在案件侦破中的重要作用日益显著。在大部分的性侵害案件中的生物物证是附着在载体上的各种斑迹，多为男性精液与女性的阴道分泌物组成的混合斑迹，但混合斑迹往往不能很好地发挥证据效能。所以为了能够更好的服务于性侵害类案件的侦破，就需要在混合斑迹中分离出单独的精子细胞DNA分型 [1]。但这类检材的检验往往很难处理，尤其是男性精子细胞数量较少，与大量的女性上皮细胞混合在载体上，想要采用常规方法把男性细胞从载体上进行分离检验十分困难，多数情况下获得的分型结果不是单一的男性分型，而是男女组分都存在的混合分型 [2]。所以为进一步提高精子细胞分离的效率，为案件侦破提供理论依据，为新分离方法的研发提供科研思路，本文对现有的精液混合斑的分离提取方法进行综合评述： 1 差异裂解法 差异裂解法是大部分科研人员最常用的方法，该方法利用精子细胞膜含有丰富的二硫键，与上皮细胞外膜特性不同的原理，通过先用十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate， SDS）和蛋白酶K裂解女性的阴道上皮细胞膜，将阴道上皮细胞的DNA分离出来后，再利用二硫苏糖醇（dithiothreitol， DTT）裂解男性精子细胞膜，然后再用常规的方法提取纯化精子DNA，从而达到使上皮细胞和精子细胞分离的目的。[3] 该方法应用广泛，却耗时长，提取过程中可能过度裂解或裂解不完全，使得精子DNA丢失，在精子含量少、女性成分含量相对很高的混合检材中，采用差异裂解法无法将女性成分完全去除，不能得到完整单一的男性STR分型。所以针对该方法的改良也较多，国内外研究者先后建立了硅珠法[4]、和DNaseI纯化结合碱性裂解法[5]等分离精子细胞的方法与此同时还研发出了Phase lock GelTM system[6]、DifferexTM system[7]、DNA IQTM system[8]、差异提取试剂盒[9]等商业化试剂盒。 虽然差异裂解法有时并不能得到理想的实验结果，但是由于其检测成本低，原理简单，仍是国内大多数研究人员处理精液混合斑的主要手段。 2 免疫磁珠分离技术 免疫磁珠分离技术是在磁性微珠上通过抗原抗体特异性结合分离和富集目标物的技术。精子细胞膜表面有很多蛋白，有些膜蛋白具有精子组织特异性，甚至是人类种属特异性，并且有较强的的抗原性。[10]筛选出合适精子细胞表面特异性抗原，制作单克隆抗体，与磁珠偶联，利用抗原-抗体反应通过精子细胞膜上相应的抗原特异性结合的免疫磁珠定向捕获精子，进而达到分离精子的目的。 免疫磁珠法所用仪器设备简单，适用于各种条件的实验室，而且该方法能够保持被分离细胞的原有生物学性状和功能，能够在分离同时进行纯化、富集。[11]虽然免疫磁珠法具有操作简便、分离效率高且可重复性好等明显的优势，但是在实际应用中，常由于精子细胞膜表面抗原的降解，无法进行直接分离的情况，还需要结合其他技术辅助完成精子细胞的分离。 3 显微操作法 显微操作法分离精子细胞是在倒置显微镜的观察视野下，通过显微操作仪，利用精子细胞的特殊形态，在混合细胞中分离与富集精细胞。 该方法可有效地获得单个细胞，尤其对微量检材分型成功率高。但对于轮奸案中的混合精斑，由于存在不同男性的精子细胞，且不能通过显微镜观察分辨，所以往往会出现分型叠加的结果。而且需要一定的经验和技巧，显微操作过程复杂；对微量精子甚至单个精子进行DNA分型时，由于模板量少，容易产生扩增不平衡、等位基因丢失或增加等问题，影响后续的DNA结果分析。[12] 4 激光捕获显微切割技术 激光捕获显微切割技术（laser capture mierodisseetion， LCM）是一种可以分离单个细胞的新技术，由于它能够在显微镜的直视下自动化的迅速准确的选取单一细胞亚群或单个细胞[13]，利用红外激光捕获技术和紫外切割技术将选取的目标细胞从混合细胞中分离出来，从而为后续的研究工作奠定基础。LCM基本原理是通过红外激光脉冲激活热塑膜，激光脉冲瞬间的高能量使目标细胞与转运膜在光斑处的粘合凝固，从而有选择性地将目标细胞或组织碎片分离出目标样品 [14]。 近年来运用单纯LCM技术，在实际检案中也获得了较满意的效果[15]，但对于一些精子形态很难辨认的检材，例如陈旧检材，该方法仍有一定的局限性。所以LCM联合免疫荧光染色技术或LCM联合FISH技术应运而生，这两种方法避免了反复的载体转移与洗脱过程，从而减少了精子细胞的损失，所以适用微量等疑难检材的分析处理。但这两种方法的设备昂贵，对操作人员要求较高；常因存在女性DNA粘附于精子细胞头部或者转移膜的情况，获得混合分型，不能达到分离出单一精子DNA的目的 [12]。 5 微流控芯片 微流控芯片（microfluidic chip）是将采集样品、前处理、反应、分离、检测等功能集中在一小块芯片上进行分析，该技术以生物化学和分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征的综合类技术 [16]。 该方法具有高速、高效、高能量、集成化、低样品与试剂消耗、易在片集成多用途功能组件等特点，且芯片的体积小、重量轻、便于携带、可进行多通量操作，非常有利于实现精子细胞的高通量、自动化分离。目前技术研究主要集中在微流控芯片上以机械操控法[17]、雙向电泳[18]及声波差异提取法[19]等方向来分离精液混合斑，但由于芯片技术还是一门新兴学科，技术发展中还存在很多的不成熟，还需要进一步的改进与完善。 6 流式细胞术 流式细胞术 （Flow cytometry， FCM）是集激光技术、电子生物技术、光电测量技术、电子计算机技术、荧光化学技术以及单克隆抗体技术于一体的高科技技术。[20]FCM是将荧光素分子与制备好的具有精子细胞表面特异性抗原的单克隆抗体偶联后，在含有精子细胞的混合液中孵育，制成带有免疫荧光标记的单细胞悬液，在细胞线性排列通过时，检测器将接收的被荧光染色的细胞所产生的荧光激发信号，与电荷及高压静电场联合作用，实现多参数、快速定量的分析和分选。[21] FCM能够将多种细胞的逐一分离，实现单个细胞水平的研究，对精子细胞相对含量极少的检材有较高的灵敏度和精准度，同时可以加入其它参数的测定，为后续的研究提供基础。但与差异裂解法相比FCM同樣存在，对设备和操作人员的要求高的缺点，不利于推广使用。 7 总结与展望 综上所述，虽然国内外研究人员依据上皮细胞与精子细胞在形态学、物理学、分子生物学等存在的差异，建立了多种分离精液混合斑的方法，但目前仍没有一种方法能够既易操作又可以有效、快速得分离精子细胞。目前随着科技的不断进步，为解决这一难题也提出了许多新的思路，也许不久的将来精液混合斑的分离将不再是个难题。 参考文献： [1]侯一平，王保捷，郭大玮，等.法医物证学[M].人民卫生出版社，340349. [2]吕德坚，陆惠玲，陈玉川.混合斑的DNA分型解析[J].法医学杂志，2002（3）：185188. [3]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002：3940. [4]袁自闯，李海燕，赵凯，等.3种分离提取混合斑精子DNA的方法比较[J].中国法医学杂志，2007，22（5）：325326. [5]袁自闯，金洪年，赖跃，等. DNaseⅠ纯化结合碱性裂解法提取混合斑精子DNA[J].中国法医学杂志，2010，25（1）：1012. [6]Kim YK， Kwon YJ. Separation and recovery of nucleicacids with improved biological activity by acid –degradable polyacrylamide gel electrophoresis[J]. Electrophoresis，2010，31（10）：16561661. [7]袁自闯，赵凯，李海燕. DifferexTM系统在混合斑精子DNA分离提取中的应用[J].中国法医学杂志，2006，21（2）：99. [8]Stacy FR， Jakobsen. Reliable noninvasive genotyping based on excrementa1 PCR of nuclear DNA purified with a magnetic bead protocol[J]. Molecular Ecology，1999，5：879. [9]吴丹，曹禹，许炎，等.差异提取试剂盒在混合斑DNA 提取中的应用[J].法医学杂志，2009，25（6）：440442. [10]张尔力，赵兴春，叶健.免疫磁珠法在分离混合斑中精子细胞的应用[J].生命科学仪器，2013，12（11）：2629. [11]郭磊，刘晓芳，韩莹，等.免疫磁珠技术和精子抗原研究进展与法医学应用[J].中国法医学杂志， 2012， 27（3）： 212214， 218. [12]刘琳，陈水琴，胡志敏，等.混合斑中精子细胞分离方法的应用研究进展[J].生命科学研究.2014，18（1）：5559. [13]Budimlija ZM， Lechpammer M， Popiolek D， et al. Forensic applications of laser capture microdissection： use in DNAbased parentage testing and platformvalidation[J]. Croat Med J，2005，46（4）：549555. [14]EmmertBuck M R， Booner R F， Smith P D， et al. Laser capture microdissection[J].Science，1996，274（5289）：921922. [15]任文彦，李彩霞，黄江平，等. PALM结合低体积扩增技术在混合斑检验中的应用[J]. 证据科学，2010，18（1）： 102109. [16]郭明星，赵保胜，高晓燕.微流控技术在医药领域的研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（18）：323327. [17]Khoshmanesh K，Nahavandi S，Baratchi S，et al. Dielectrophoretic platforms forbidomicrofluidic systems[J]. Biosensors and Bioelectronics，2011，26（5）：18001814. [18]Horsman KM，Bienvenue JM，Blasier KR，et al. Forensic DNA analysis on microfluidic devices： a review[J]. Journal of Forensic Sciences，2007，52（4）：784799. [19]Norris JV，Evander M，Horsman M，et al. Acoustic differential extraction for forensic analysis of sexual assault evidence[J]. Analytical Chemistry，2009，81（15）：60896095. [20]李华，常莹.流式细胞仪工作原理与临床应用[J].中国医疗器械信息，2011，（5）：3739，45. [21]马志宏，张建军.流式细胞仪工作原理及其在精子分离中的应用[J].甘肃畜牧兽医，2008，（3）：3739. 作者简介：王婧茹（1988），女，宁夏人，本科，法医师，主要从事法医物证检验工作。 |
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